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红树林放线菌的分离及其生物活性物质的初步研究

肖静  
【摘要】: 红树林是热带或亚热带海岸潮间带所特有的木本植物群落,具有非常重要的经济和生态学价值。红树林蕴涵着丰富独特的海洋微生物资源,特别是以次级代谢产物多样性而著称的放线菌。 本文以福建漳江口红树林自然保护区的土壤沉积物为样品,选择性分离培养其中的放线菌。以枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色假丝酵母和水稻纹枯病原菌为指示菌检测分离株发酵液的抗菌活性,结果显示42.3%的放线菌发酵液具有抗菌作用。以肝癌细胞BEL7402、肺癌细胞A549和白血病细胞HL60三种肿瘤细胞为指示细胞检测分离株发酵液的细胞毒活性,结果显示37.4%的放线菌发酵液对肿瘤细胞具有毒活性。 对所分离菌株的16S rDNA的序列多样性分析发现其中163株分离菌株分属链霉菌(89%)、小单孢菌(6.1%)、糖单孢菌(0.6%)、马杜拉放线菌(3.7%)和拟诺卡氏菌(0.6%)属。其中三株链霉菌MGR035、MGR082、MGR105与已知链霉菌Streptomycescaparticus、Streptomyces glauciniger、Streptomyces cacaoi subsp.cacaoi的相似性低于97%,可能为三个新种。 用根据负责聚酮类化合物主链合成(Ⅰ/Ⅱ型PKS)和非核糖体肽合成(NRPS)的基因保守区域设计的3对兼并引物,分别对分离菌株的基因组进行PCR检测,以扩增片段的有无来衡量菌株产活性物质的潜力并分析扩增片断的多样性。已检测的77株菌包括放线菌的5个属,其中链霉菌是产生聚酮类化合物和非核糖体多肽的最丰富的菌源:66株链霉菌的Ⅰ型PKS基因的阳性率为36.4%,Ⅱ型PKS的阳性率为59.1%,NRPS的阳性率为51.5%;其他种属(包括小单孢菌属和稀有放线菌属)的菌株也检测到PKS和NRPS的基因。 对菌株的抗菌活性和细胞毒活性测定结果与次级代谢产物合成相关基因扩增结果进行比较发现两者无一一对应联系。不显示抗菌或细胞毒活性的菌株中有的依然存在次级代谢产物合成相关基因。而16S rDNA序列相似性高的菌株可能具有不同的抗菌活性和不同的PKS/NRPS合成基因。同时部分稀有放线菌的PKS基因序列与链霉菌的进化关系较远,可能具有合成结构新颖的化合物的潜力。这些结果显示本文分离的放线菌菌株不仅具有种属的多样性,在次级代谢合成相关基因上具有更复杂的多样性。 以两株没有检测到抗菌活性,但PCR检测具有聚酮合酶和非核糖体多肽合成能力的链霉菌MGR157、MGR010为出发菌株,引入抗生素抗性,分别筛选获得MGR157的链霉素、庆大霉素抗性突变株和MGR010的利福霉素抗性突变株。用生物测定检测抗性突变株的抗菌活性发现,部分突变株获得抗菌活性且突变株的菌落形态、孢子颜色等表型与出发菌株有显著的差异。实验结果表明应用通过引入核糖体蛋白突变的核糖体工程技术,能够激发海洋放线菌产活性物质的潜能,从而提高红树林放线菌菌种资源的利用效率。


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