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柿及其部分近缘种mtDNA和cpDNA多态性分析

胡德昌  
【摘要】: 柿(Diospyros kaki Thunb.)为柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros L.)植物。本试验基于胞质基因组,包括线粒体基因组和叶绿体基因组具有母性遗传等特点,分别对柿及其部分野生近缘种材料涵盖了7个种(柿D.kaki Thunb.;君迁子D.lotus L.;浙江柿D.glaucifolia Metc.;油柿D.oleifera Cheng;金枣柿;老鸦柿D.rhombifolia Herosl.;美洲柿D.virginian L.)进行亲缘关系分析,以期从胞质基因组DNA水平上明确柿品种、种的亲缘关系和分类地位,为柿属植物资源利用提供科学依据。主要结果如下: 1.应用在其他高等植物开发的34对mtDNA特异引物,对柿属植物6个近缘野生种及柿种下20个品种线粒体基因非编码区DNA序列进行PCR扩增。结果表明:1)选用的32对引物能扩增线粒体基因间隔区和内含子区域,并检测到110个变异位点,说明mtDNA在序列进化和基因重组过程中存在大量变异;2)其中23对引物能检测到栽培柿种下扩增多态位点,聚类分析表明原产中国甜柿种质和日本甜柿种质完全分开,两者可能具有不同起源;3)中国原产甜柿宝盖甜柿和鄂柿一号具有部分特异谱带,根据线粒体基因组母系遗传规律,推断其可能具有相同母本。 2.应用10对叶绿体DNA通用引物对柿属植物6个近缘野生种和柿种内23个品种的叶绿体基因组非编码区DNA序列进行PCR扩增。共扩增柿属植物cpDNA约20.4 kb,占其叶绿体基因组12.7%。扩增产物分别应用7种限制性内切酶酶切,琼脂糖电泳检测结果表明:1) cpDNA在柿属植物中存在丰富的种间多态性,但柿种各基因型未能检测到明显的遗传变异位点,仅在trnS-trnfM/RsaI组合检测到雄株9号位点变异;2)栽培柿酶切谱带模式与4倍体老鸦柿和6倍体美洲柿差异明显,而与君迁子差异最小。3)应用NTSYS程序中主坐标分析和PHYLIP中Wagner简约法分析得出,在柿进化过程中2倍体的君迁子、浙江柿亲缘关系较近,而与多倍体的美洲柿和老鸦柿却相距甚远;4)金枣柿产生与柿属植物其他种不同的谱带模式,综合形态学特征推断其为柿的一个新近缘种。 3.应用通用引物扩增10个柿属基因型(包括9个柿品种和1个近缘种)叶绿体基因组trnS-trnfM区域,克隆测序得长度为1155bp~1160bp的核苷酸序列,包含trnS,psbZ,trnG和trnfM基因编码序列及其基因间隔区序列。共检测出17个序列突变位点,包括11个碱基替换,3个碱基插入和3个碱基缺失位点。供试中国原产柿品种突变位点2个,日本原产柿品种为14个,差异显著。相对古老的柿品种此区域序列保守且高度同源,而近期选育出的阳丰变异水平最高,部分变异位点与母本富有相同。邻接法分析结果表明原产中国的柿种质与日本柿种质分别聚类,推测两者具有不同起源。序列比对和系统发育分析结果均表明中国原产完全涩柿磨盘柿与完全甜柿宝盖甜柿和鄂柿1号起源亲本亲缘关系较近。 4.应用mtDNA通用引物特异扩增柿线粒体基因组ORF25区域,并对目的片段进行克隆测序,通过序列比较检测柿品种间mtDNA ORF25区域序列多态性,鉴定目的片段为特异扩增产物。结果表明此区域存在部分碱基变异位点,且发生了序列拷贝。系统分析表明不完全甜柿禅寺丸和不完全涩柿平核无分化时间较短。选取中国和日本不同脱涩类型、不同倍性的柿属植物对12对cpSSR引物进行通用性检测,并初步探究其应用潜力。来源于柑橘类ARCP4,ARCP5,ARCP9和来源于烟草ccmp3,NTCP9,NTCP40的6对cpSSR引物能够在供试材料中扩增得到目的片段。结果表明,在其他作物开发的cpSSR引物具有较高的通用性,在柿属植物的叶绿体基因组研究领域具有潜力。 5.以完全涩柿磨盘柿为母本,授以完全甜柿罗田甜柿花粉,进行大田杂交育种。荧光显微镜检测花粉与柱头亲和性,应用胚挽救技术对所得到的种子进行幼胚培养获得杂交后代植株。应用RAPD和SSR分子标记对F_1代遗传分析,并与原产中国部分甜柿种质比较。罗田甜柿花粉在磨盘柿柱头上可以萌发,但大多数产生胼胝质塞,亲和力较低,仅有少量正常受精。磨盘柿为单性结实,并具有有性杂交能力。在磨盘柿×罗田甜柿186个人工授粉处理中共得到82个果实,13个种子;RAPD和SSR检测结果表明所获得的幼胚培养植株为其F_1代,部分单株与宝盖甜柿和鄂柿1号等中国现有甜柿种质扩增图谱部分位点相同。 综上所述,本研究应用通用引物特异扩增部分柿属植物的胞质基因组,包括线粒体基因组和叶绿体基因组的部分区域,扩增产物直接通过琼脂糖凝胶检测、限制性内切酶酶切和克隆测序比较供试材料的遗传多态性,并应用UPGMA、主坐标分析和Wanger简约法进行聚类,分析遗传关系。胞质基因组所反映的材料间的遗传关系与总基因组多种分子标记分析结果大致相同。分析结果表明:1)柿mtDNA存在丰富变异;2) cpDNA PCR-RFLP可适用柿属植物种间水平系统进化研究;3)多倍体的老鸦柿、美洲柿和柿具有不同的进化途径;4)金枣柿应为柿的一个新近缘野生种;5)磨盘柿的结实方式和罗田甜柿雄花特性为两者成为甜柿育种亲本提供了可能。


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