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猪肌肉生长相关转录因子的克隆、启动子调控及遗传效应分析

刘敏  
【摘要】: 肌肉调节因子(Muscle Regulatory Factors,MRFs)和生肌增强因子2(MyocyteEnhancer Factor-2,MEF2)两个转录因子家族组成的核心调控网络在骨骼肌生长发育过程中起着决定性的调控作用。MRFs家族包括MyoD、MyoG、Myf5和Myf6;MEF2家族包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D。MRFs的结合位点与MEF2的结合位点在肌肉组织特异性基因的调控区普遍存在。MRFs通过与E蛋白家族的另一类bHLH蛋白形成异二聚体识别并结合MEF2基因5’UTR上的E-box,从而诱导启动MEF2基因的表达。而MEF2又可以结合于MRFs基因启动子区内的MEF2序列,放大和维持MRFs的基因表达。两家族转录因子互相作用形成一个正向反馈环,从而共同调控肌肉特异性基因的表达,决定肌肉的生长发育。因此,本研究对猪MRFs和MEF2两个转录因子家族基因进行了分离、克隆、启动子调控和遗传效应分析,取得了以下结果: 1.猪MEF2A、MEF2C和Myf6基因cDNA序列的分离和克隆:采用电脑克隆和RACE技术,克隆MEF2A和MEF2C基因cDNA全长序列以及Myf6基因的3’UTR序列,其中MEF2A基因GenBank登录号为EF194143,cDNA全长2818 bp,ORF为1416 bp,编码472个氨基酸,5’UTR长360 bp,3’UTR长1042 bp;MEF2C基因GenBank登录号为EF486522,cDNA全长4365bp,ORF为1392 bp,编码464个氨基酸,5’UTR有363 bp,3’UTR长2610 bp;Myf6基因GenBank登录号为DQ139774,3’UTR长638bp。 2.猪MEF2A和MEF2C基因的生物信息学分析:利用Clustal X、ORF Finder、SignalP2.0、ANTHEPORT、PSORTⅡ、TMprep等软件对猪MEF2A和MEF2C基因结构、所编码的蛋白质结构、功能、系统进化等特征进行了预测和分析,并构建了分子系统进化树。 3.猪MEF2C基因的选择性剪切体鉴定:设计引物以猪肌肉组织cDNA为模板扩增得到大小不同的片段。经测序和序列分析证实不同带型分别代表猪MEF2C的两种不同剪切体MEF2C-1和MEF2C-2。剪切体MEF2C-1比MEF2C-2多96bp的核苷酸序列,相差32个氨基酸,同时对猪MEF2C-1和MEF2C-2两种转录本所编码的蛋白质结构、功能、系统进化等特征进行了预测和比较,并构建了分子系统进化树。 4.MEF2A和MEF2C基因的部分基因组序列的获得及SNP的发现:根据已获得的cDNA序列,扩增了MEF2A和MEF2C基因的部分内含子序列,并分析了其在不同猪种中的多态性。MEF2A基因第6内含子长度为1001bp,在其上发现了5个SNP位点,颠换突变2个,转换突变3个。其中A157G变异,引起了限制性内切酶MspI的酶切位点变化;MEF2C基因第7和8内含子分别为2556bp和756bp,在其上发现了5个SNP位点,转换突变3个,插入缺失突变2个。所有内含子5’端都为GT,3’端都为AG,符合“GT-AG”法则。 5.MEF2C、Myf5和Myf6基因启动子序列的获得及生物信息学分析:利用基因组PCR步移法从猪的基因组中扩增出了MEF2C和Myf5基因5’侧翼2427bp和1970bp的序列。利用比较基因组法从猪的基因组中扩增出了Myf6基因5’侧翼1089bp的序列。利用NNPP、MethPrimer、TESS等生物信息学软件对猪MEF2C、Myf5和Myf6基因的核心启动子、转录起始位点、CpG岛的分布以及与启动子相结合的转录因子进行了预测和分析。另外,在Myf6基因的启动子区发现13处SNP,颠换突变3个,转换突变9个,插入/缺失突变1个。 6.猪Myf5、MyoD、Myf6基因部分DNA序列的SNP筛查:(1)Myf5,发现了26个SNP位点,颠换突变6个,转换突变11个,插入/缺失突变9个;(2)MyoD,发现了8个SNP位点,颠换突变4个,转换突变4个;(3)Myf6,发现了8个SNP位点,颠换突变4个,转换突变4个。 7.Myf5、MyoD、Myf6和MEF2A的遗传效应分析:利用PCR-RFLP分子标记技术,以华中农业大学试验猪场2002年屠宰的大白猪、长白猪和梅山猪等三个品种和大白猪×长白猪、长白猪×大白猪、大白猪×梅山猪、梅山猪×大白猪等四个杂交组合群体(共321头)以及2000、2003、2004年屠宰的大白猪×梅山猪杂种猪F_2代群体(共403头)为试验猪群,对猪MRFs和MEF2两个转录因子家族基因Myf5、MyoD、Myf6和MEF2A中存在的SNP进行了验证与基因型分型,与胴体、肉质等经济性状进行关联分析结果表明,Myf5-BcnI-RFLP的不同基因型主要与屠宰率和瘦肉率显著相关,且瘦肉率的加性效应显著;Myf5-Hsp92Ⅱ-RFLP的不同基因型主要与肥肉率、肩部最厚处膘厚、胸腰椎间膘厚、平均膘厚、至第一肋胸胴体长、肌内脂肪和肌内水分显著和极显著相关,其中胸腰椎间膘厚、至第一肋胸胴体长、肌内水分的加性效应显著;Myf5-HinfI-RFLP的不同基因型主要与背最长肌pH值接近显著相关;Myf5-MspI-RFLP的不同基因型主要与6-7胸椎间膘厚、胸腰椎间膘厚、至第一肋胸胴体长和背最长肌pH显著相关,其中6-7胸椎间膘厚、背最长肌pH的加性效应显著;MyoD-DdeI-RFLP的不同基因型主要与至第一肋胸胴体长和6-7胸椎间膘厚显著相关;Myf6-TasI-RFLP的不同基因型主要与瘦肉率接近显著相关,与背最长肌pH、背最长肌大理石纹和股二头肌大理石纹性状显著相关,其中背最长肌大理石纹和股二头肌大理石纹的加性效应显著;MEF2A-MspI-RFLP的不同基因型主要与瘦肉率、臀部膘厚、内脂率、背最长肌pH值、股二头肌pH值、失水率和系水力有显著和极显著相关,其中胸腰椎间膘厚、臀部膘厚的加性效应显著。


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