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产壳聚糖酶菌株的选育及产酶发酵工艺研究

胡远亮  
【摘要】: 通过富集培养,初筛,复筛,粘度快速测定以及薄层层析(TLC)分析,从自然界中分离到3株产内切壳聚糖酶活力较高的菌株。经形态、生理生化特征鉴定以及16S rDNA序列分析,3株均归属于Mitsuaria sp.,分别命名为013、和281。其中,Mitsuaria sp.141的产酶能力最强。 以Mitsuaria sp.141为出发菌株,先后进行紫外诱变和~(60)Co-γ射线诱变,选育到菌株Mitsuaria sp.141-2,其壳聚糖酶活力提高了30.01%。连续传5代,每代测定酶活力,结果表明,该菌株具有较好的遗传稳定性。 通过单因素试验和多因素试验对Mitsuaria sp.141-2发酵进行了研究,得到了优化的产酶工艺:可溶性壳聚糖0.50%、装液量100 mL(500 mL三角瓶)、起始pH值7.0、接种量2%、温度30℃、摇床转速180 r/min、培养时间48 h,在此条件下,酶活力达3.631 U/mL。在10 L容量的发酵罐中扩大培养,装液量7 L、通气量1 vvm、搅拌速率200 r/min、温度30℃,培养36 h壳聚糖酶活力达最高值3.258 U/mL。 TLC分析表明,壳聚糖的酶解产物中有壳二糖或其它壳寡糖存在。用乙酰丙酮法测定产物壳聚糖的数均分子量,结果表明,1.5%的壳聚糖胶体溶液与粗酶液体积比15:1,37℃、作用30 min,产物数均分子量降到10921。保持作用条件不变,改变体积比为10:1、5:1、2:1、1:1和1:2,产物的数均分子量逐渐变小,分别为5683、3018、1247、779和747。 通过硫酸铵沉淀、离心超滤和Sephadex G-200凝胶柱层析,初步纯化了Mitsuaria sp.141-2壳聚糖酶,该酶为诱导酶,分子量33.6 kD,最适作用pH值为4.0,最适作用温度为37℃~42℃,在45℃以下、pH4.0~pH8.0的环境中较稳定。


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