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TMEM66基因功能初步研究

李新云  
【摘要】: 免疫系统是机体中一个极为重要的防御系统,其功能不正常,机体的生命就会受到威胁。免疫系统中起核心作用的是免疫细胞,均起源于骨髓中的造血干细胞。因此,造血干细胞的正常分化对维持机体免疫系统的功能是至关重要的。TMEM66(transmembrane protein 66)基因可能与免疫细胞的分化密切相关。本研究拟从分子水平、细胞水平及个体水平探讨TMEM66基因的功能。主要研究工作和结果如下: 1 TMEM66基因功能预测 TMEM66基因是一个新的功能基因,目前还没有该基因的专门研究报道,其功能也不清楚。本研究拟通过对TMEM66基本生物学信息进行收集整理,并对TMEM66的结构和功能进行初步预测,为研究该基因的功能奠定一定的基础。结果显示:TMEM66是一个三跨膜蛋白,含有一个DUF1183功能域;人TMEM66基因在分化成熟的免疫细胞如B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞中高表达,在脑、脊髓、淋巴结和血液中也高表达,而在白血病细胞(HL60、Molt4、K562)及恶性淋巴瘤细胞系(Raji、Daudi)等未分化成熟的免疫细胞中低表达;在癌变组织中该基因表达下调。以上研究结果表明:TMEM66基因可能与免疫细胞的分化相关,低表达TMEM66基因与癌症发生相关。 2 TMEM66基因分子水平研究 根据生物信息学分析的结果,推测TMEM66基因是一个与细胞分化相关的新基因。本研究拟对猪TMEM66基因进行克隆、定位、多态分析,并对猪和人TMEM66基因的表达规律进行研究,为阐明该基因的功能提供分子生物学依据。结果显示:扩增得到猪TMEM66基因片段长度为1886bp,包含一个完整ORF编码337氨基酸,与人TMEM66蛋白(NP_057211)同源性达84%;猪TMEM66基因定位于猪15号染色体q臂与微卫星SW1673紧密连锁;在猪TMEM66基因CDs区发现了一个A/C多态,基因频率检测发现只在巴马猪群中存在等位基因A且A等位基因频率远远高于C等位基因,其它群体中都只有等位基因C,没有A等位基因;猪TMEM66在肺、脾、淋巴结、脑组织中高表达,而在骨骼肌、心肌和脂肪中低表达;人TMEM66在癌变组织或细胞中比其对应的正常组织表达量下降;TMEM66基因随着胚胎的生长发育呈现上调表达趋势;ATRA诱导U937分化过程中,TMEM66基因呈现上调趋势,48h表达到达高峰,以后呈现下调趋势;以上研究结果表明:TMEM66基因可能与细胞分化相关。 3 TMEM66基因细胞水平研究 TMEM66基因是一个膜蛋白,其亚细胞定位及表达水平与功能密切相关。本研究对人TMEM66基因进行了亚细胞定位;并构建慢病毒过表达载体,研究过表达该基因对细胞周期的影响,进一步从细胞水平探讨TMEM66基因的功能。结果显示:TMEM66分布于细胞核膜上。本研究中发现人TMEM66还存在其它两个转录本。第二转录本比TMEM66缺少了第一跨膜域及部分第一膜内域;第三转录本缺少了第一膜内域及第一膜内域。推测它们可能与TMEM66的功能调节相关。对TMEM66第三个转录本进行亚细胞定位,结果表明第三个转录本分布于细胞质及细胞核膜;对TMEM66互作蛋白IFIT5进行亚细胞定位分析,结果发现IFIT5分布于细胞质中;通过慢病毒介导TMEM66在U937细胞中过表达研究,发现过表达TMEM66导致细胞凋亡增加。经ATRA诱导不同时间点检测细胞周期,结果发现TMEM66过表达的U937细胞G2期比率比对照组高,凋亡比率也比对照组高。以上研究结果表明:TMEM66基因是一个核膜蛋白,过表达TMEM66基因导致细胞凋亡增加,在诱导细胞分化过程中,过表达TMEM66可导致细胞G2期抑制并促使G2期抑制的细胞发生凋亡。 4 TMEM66基因突变体转基因小鼠构建 为了从个体水平探讨TMEM66基因的功能,本研究采用显微注射法制作TMEM66突变体转基因小鼠,为进一步研究该基因的功能奠定基础。结果显示:出生的55只小鼠中,通过PCR法和Southern杂交检测,有6只为阳性鼠,传代研究发现3只阳性鼠可以稳定传代,外源基因片段以串联重复的方式整合到小鼠的基因组中,RT—PCR检测发现转入的突变基因在多个组织中转录。以上研究结果表明:通过显微注射法得到了3只可以传代的转基因阳性鼠,为以后从个体水平研究该基因的功能奠定了基础。


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1 李新云;TMEM66基因功能初步研究[D];华中农业大学;2007年
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