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猪四个候选基因的分离、鉴定及分子标记与杂种优势的关联分析

黄京书  
【摘要】:随着分子标记技术的应用和发展,以之为基础的分子标记辅助选择和渗入等分子育种技术与常规育种方法相结合极大地加速了猪遗传改良的进程。分子标记辅助选择的基础是寻找与重要经济性状相关的主效基因或分子标记。而骨骼肌是动物体内最丰富的组织,其生长发育相关性状是肉用家畜最重要的性状。因此,本研究筛选4个与肌肉生长发育和代谢相关的基因作为猪生产性状候选基因进行了研究,并利用本研究发现的4个SNPs标记和21个已报道的微卫星标记探讨了分子标记与杂种优势的关系。具体研究结果如下: 1.谷胱甘肽S转移酶M2(Glutathione S-transferasc M2,GSTM2):(1)获得了大白猪、长白猪、梅山猪三个猪种GSTM2基因编码区序列5’-RACE序列和部分基因组序列。(2)利用CLUSTALW、CDD、Signal P3.0、Prosite等软件对所编码蛋白质的结构、功能等特征进行了预测和分析,并构建了系统进化树。(3)序列比对发现了32个潜在SNPs,其中,第5外显子的C27T突变会导致无义突变(CGA→TGA)从而产生一个提前终止密码子(premature translation terminationcodon,PTC)。(4)建立了第5外显子C27T替换的PCR-TaqⅠ-RFLP基因分型方法,在所检测的7个不同猪群中未发现TT基因型,所有群体中C等位基因的频率都要高于T等位基因的频率,尤其在大长和长大群体中C等位基因的频率达到了1而T等位基因的频率为0。(5)标记与性状关联分析发现GSTM2基因型与肥肉率、瘦肥比率、骨率、背膘厚性状以及至第一颈椎胴体长和至第一胸肋胴体长相关极显著,CC基因型的个体比CT基因型的个体具有更低的背膘厚、肥肉率和更高的瘦肥比率、骨率以及胴体长。(6)对第5外显子C27T无义突变进行了无义介导mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)的可能性分析,发现当猪DNA中该位点存在T等位基因时其cDNA中该位点不存在T等位基因,说明由于PTC的存在,T等位基因所转录的mRNA可能发生了无义介导的mRNA降解。(7)通过组织表达谱分析发现GSTM2在肝和睾丸中表达量最高,其次是肌肉、脂肪、脾、肺,在肾中表达量较低,在心和胚胎中表达量最低。(8)通过Real-time RT-PCR分析发现在大白和梅山两个品种骨骼肌中,GSTM2的表达量都随着日龄的增加而降低,GSTM2在大白和梅山两个品种中的表达量没有明显差异。 2.肌联蛋白帽(Titin-cap,TCAP):(1)获得了大白猪、长白猪、梅山猪三个猪种TCAP基因编码区序列和内含子序列。(2)利用CLUSTALW、CDD、SignalP3.0、Prosite等软件对所编码蛋白质的结构、功能等特征进行了预测和分析,并构建了系统进化树。(3)序列比对发现了4个潜在SNPs,建立了第2外显子G334A替换的ASP基因分型方法,在所检测的7个不同猪群中除了梅山之外,在所有猪群中G等位基因的频率都要高于A等位基因的频率,尤其在长大群体中G等位基因的频率达到了1。(4)标记与性状关联分析发现TCAP基因型与屠宰率、瘦肉率、6-7腰椎间背膘厚、胸腰椎间背膘厚、臀部平均背膘厚、三点平均背膘厚、眼肌高、眼肌宽、至第一颈椎胴体长、至第一胸肋胴体长,肥肉率、肩部背膘厚、瘦肥比率、失水率、系水力、背最长肌色值、肌内水分等性状显著或极显著相关。(5)通过组织表达谱分析发现TCAP在肌肉、心、肾、胚胎中表达量较高,在脂肪和肺中表达量有所下降,在脾、肝中表达量较低,在子宫、卵巢、胃中不表达。(6)通过Real-timeRT-PCR分析发现TCAP在大白和梅山两个品种骨骼肌中的表达量都随着日龄的增加而降低,初生时表达量极高,60日龄时表达量急剧下降,到120日龄时表达量仍有所下降,但下降不明显。在60日龄和120日龄这两个阶段,TCAP在大白中的表达量比在梅山中高。 3.肌动蛋白α2(Actin,Alpha 2,ACTA2):(1)获得了大白猪、长白猪、梅山猪三个猪种ACTA2基因编码区序列和部分基因组序列。(2)利用CLUSTALW、CDD、Signal P3.0、Prosite等软件对所编码蛋白质的结构、功能等特征进行了预测和分析,并构建了系统进化树。(3)序列比对发现了27个潜在SNPs,建立了第2内含子C1554T替换的PCR-HinfⅠ-RFLP基因分型方法,在所检测的7个不同猪群中大白群体C等位基因的频率要低于T等位基因的频率,梅大群体中C等位基因和T等位基因的频率相同,其他群体中均是C等位基因频率要高于T等位基因的频率。(4)标记与性状关联分析发现ACTA2基因型与皮率、肩部背膘厚、肥肉率、瘦肉率、臀部平均背膘厚、眼肌高、股二头肌pH和肌内脂肪显著或极显著相关,TT基因型与CC基因型相比具有更高的瘦肉率以及更低的肥肉率和背膘厚。(5)通过组织表达谱分析发现ACTA2在肌肉、子宫、肾中表达量较高,在胚胎、脾、卵巢、胃、肺中表达量有所下降,在心中表达量较低,在脂肪、肝中表达量最低。(6)通过Real-time RT-PCR分析发现ACTA2在大白和梅山两个品种骨骼肌中的表达量都随着日龄的增加而降低,在各个阶段,梅山中的表达量都比大白中的表达量要高。 4.双特异性磷酸酶13(Dual Specificity Phosphatase 13,DUSP13):(1)获得了大白猪、长白猪、梅山猪三个猪种DUSP13基因部分cDNA序列和部分基因组序列。(2)利用CLUSTALW、CDD、Signal P3.0、Prosite等软件对所编码蛋白质的结构、功能等特征进行了预测和分析。(3)序列比对发现了16个潜在SNPs,建立了第1内含子T302C替换的PCR-HinfⅠ-RFLP基因分型方法,在所检测的7个不同猪群中T等位基因的频率都要高于C等位基因的频率。(4)标记与性状关联分析发现DUSP13基因型与屠宰率、眼肌高、眼肌宽、瘦肥比率、肥肉率、瘦肉率、背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹和肌内脂肪显著或极显著相关。(5)通过组织表达谱分析发现DUSP13在肌肉、卵巢中表达量最高,在肾、肺中表达量有所下降,在胚胎、子宫、心、脾、脂肪、肝中表达量较低,在胃中表达量最低。(6)通过Real-time RT-PCR分析DUSP13基因在不同品种、不同发育阶段骨骼肌中的表达情况,发现在大白品种中,1日龄时DUSP13表达量最高,到60日龄时表达量急剧降低,120日龄时表达量又有所上升。而在梅山品种中,DUSP13表达量随着日龄的增加呈现逐渐降低的趋势。另外,在60日龄时,DUSP13在梅山中的表达量要比在大白中高,而在120日龄时,大白中的表达量又比梅山中高。 5.分子标记与性状杂种优势的单标记分析:在大长+长大,大梅+梅大群体中对10个性状的杂种优势进行了单标记分析,发现了在两个群体中共有的极显著意义标记位点:SWR2516(眼肌面积);SW2408和S0165(皮率);SW2185,SW2021和SW1443(瘦肉率);SW1879(初生重);SW2185(料肉比);SW1879(平均背膘厚)。 6.个体杂合度与性状杂种优势的关联分析:在大长+长大和大梅+梅大群体中进行了个体杂合度与性状杂种优势的关联分析,结果在两个群体中,个体杂合度与初生重杂种优势都表现出显著的正相关。另外,个体杂合度与平均背膘厚杂种优势在大长+长大群体中也表现出显著的正相关,其他性状杂种优势与个体杂合度在两群体中都没有表现出显著的相关性,且这些非显著的相关有正相关也有负相关。 7.不同个体杂合度水平间杂种优势的差异:在大长+长大和大梅+梅大群体中对杂种优势在不同个体杂合度水平间的差异进行了分析,结果在两个群体中,皮率的杂种优势在不同的个体杂合度水平间都表现出极显著的差异,另外,在大梅+梅大群体中,骨率、初生重、日增重的杂种优势在不同的个体杂合度水平间差异显著。所研究的大部分性状杂种优势在大梅+梅大群体中都有随个体杂合度水平增加而增加的趋势。


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