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拟南芥成膜素相关蛋白(PhrIP1)在植物细胞板形成中的功能研究

马立安  
【摘要】: 植物细胞有丝分裂后期由高尔基体衍生而来的泡囊沿着成膜体微管向赤道板移动,到达赤道板整齐排列,与成膜体微管共同形成桶状成膜体。在赤道板上成膜素缠绕在泡囊外,将泡囊挤压成哑铃型(VTV),同型VTV融合形成膜结构状细胞板。细胞板的形成是一个连续的膜融合过程,随着细胞板离心生长,膜融合发生在延伸细胞板的生长边缘,到达母细胞壁并与母细胞壁融合形成新生细胞壁,将母细胞分裂成2个子细胞。细胞板形成与生长影响细胞的分裂,与植物细胞的周期循环、组织器官发育、形态构建等息息相关。 植物动力蛋白—成膜素存在于成膜体中,在细胞板形成的早期泡囊融合中发挥重要作用。成膜素相关蛋白(phragmoplastin-interacting protein1,PhrIP1)是从拟南芥cDNA文库中分离出来的与成膜素相互作用的蛋白,在细胞分裂后期与成膜素共同定位于细胞板上。该蛋白结构中有1个富含赖氨酸的核定位结构域、2个RNA结合位点和3个锌指结构,是一个新型的RNA结合蛋白。 我们推测PhrIP1的潜在功能:在植物细胞分裂前(间期),PhrIP1可能结合参与细胞板形成的某种重要基因的mRNA,调节该基因的转录后的表达,为细胞后期分裂作准备;在细胞分裂后期,PhrIP1可能结合该基因产物或其它蛋白,共同调节或促进成膜素起始复合物的形成,激发细胞板形成和延伸的早期泡囊融合。为探索PhrIP1在细胞板形成中的作用,本文从以下5个方面对PhrIP1的潜在功能进行了研究。 1、利用酵母双杂交技术研究与PhrIP1相互作用的靶蛋白 用PhrIP1作诱饵,通过酵母双杂交(LiAc-SS-DNA-PEG酵母高效转化)方法筛选拟南芥AD-cDNA文库,经Leu营养缺陷型初筛获得1925个克隆,X-Gal显色复筛得到181个克隆,酵母菌落PCR检测获得90个克隆,抽提质粒经酶切、PCR鉴定得到68个质粒,再经回复验证获得60个阳性质粒,核苷酸测序结果分析,获得46个与PhrIP1相互作用的蛋白质的编码基因。选择其中4个基因进行克隆表达,纯化其蛋白,经体外蛋白质与蛋白质相互作用研究,证实4个靶蛋白均能与PhrIP1具有相互作用;经蛋白质结构分析和功能预测,确定33~#基因编码的小GTP结合蛋白Ran2(Ras-related nuclear protein)作为研究的靶蛋白。 2、利用亲和吸附法研究与PhrIP1相互作用的mRNA 利用与GSTBeads结合的GST-PhrIP1融合蛋白吸附拟南芥总RNA,提取结合的RNA,测定OD_(260)值,经RT-PCR鉴定PhrIP1特异结合的mRNA。将被特异结合基因克隆到pTYB2(含T7启动子)载体上,在体外转录mRNA并用[α-~(32)P]rUTP标记探针,经紫外交联、RNA凝胶电泳迁移试验(REMSA)研究PhrIP1结合特异RNA的能力。结果表明PhrIP1能特异性结合Ran2-mRNA。 3、小GTP结合蛋白Ran2的GTPase活性、表达谱及亚细胞定位分析 Ran2基因结构分析显示,Ran2含有5个外显子和4个内含子,其cDNA编码约24kD蛋白,该蛋白含有221氨基酸。在大肠杆菌中表达、纯化Ran2蛋白,用钼铁盐法测定其GTPase活性。结果表明Ran2具有固有的GTP酶活性。RT-PCR和Western blot分析结果表明,Ran2-mRNA在拟南芥根、茎、叶、花中均表达;Ran2蛋白存在存在植物可溶性部分中。荧光抗体定位结果表明,Ran2参与细胞有丝分裂的各个过程,在细胞有丝分裂间期,Ran2主要定位于核膜上,前期分散于细胞质中,后期定位于赤道板和纺锤体上,末期又回到子细胞核膜上。 4、不同植物Ran2基因的克隆及同源性分析 从洋葱、大蒜发芽根和油菜幼苗中抽提RNA,用拟南芥Ran2引物和RT-PCR方法克隆Ran2基因,测序比对分析结果表明:拟南芥Ran2基因与洋葱、大蒜和油菜Ran2的核苷酸序列同源性分别为99.70%、100%、89.94%;氨基酸序列同源性分别为99.10%、100%、96.38%(除了大蒜Ran2 C末端缺少一个天冬氨酸D外)。这些结果表明Ran2在植物进化中高度保守。 5、PhrIP1突变体分析及PhrIP1、Ran2基因超表达和RNAi载体的构建 栽培拟南芥PhrIP1(T-DNA)突变体与野生型,观察其表型并进行分子生物学分析。结果显示,PhrIP1突变体与野生型在表型上没有明显差异。RT-PCR检测PhrIP1-mRNA均为阳性。在植物可溶性蛋白中,利用PhrIP1抗体进行Western blot分析均未检测到PhrIP1。PhrIP1是一种膜相关蛋白,与细胞的膜成分紧密结合不易被浸提出来。T-DNA插入的PhrIP1突变体仍可转录其mRNA,说明该突变体以非纯合体存在(PhrIP1为植物必需基因,如果形成纯合体,植株则不能存活)。为了进一步研究PhrIP1和Ran2基因在植物细胞板形成过程中的作用,本研究构建了超表达载体pBI-PhrIP1和pBI-Ran2,RNAi干扰载体Hellsgate2-PhrIP1和Hellsgate2-Ran2,GFP融合蛋白表达载体pMON-GFP-PhrIP1;进行了拟南芥遗传转化,收获了T_0种子,其表型正在观察中。


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