猪GNMT和GLP-1R基因的克隆、多态性分析及组织表达谱研究

【摘要】： 分子标记辅助选择与传统育种方法相结合已经是目前猪遗传改良工程所采取的主要方法之一，作为分子标记辅助选择的基础，寻找与重要经济性状相关的主效基因和分子标记是十分关键的。随着人、鼠、猪分子遗传图谱、QTL定位以及功能基因组研究的深入，我们利用已报道的与猪重要生产性状相关的QTL，在与之同源的人、鼠等染色体区域内选择与经济性状可能相关的候选基因也是一种切实可行的筛选新基因的方法。基于此，本研究根据国内外最新的关于猪7号染色体与人6号染色体基因图谱同源区段比较的研究进展以及猪生产性状的QTL的定位信息，从该区段中寻找了2个与猪生产性状有关的基因进行了研究，并取得了以下结果： 1．GNMT(Glycine-N-Methyltransferase，甘氨酸-N-甲基转移酶) (1)所编码的酶是肝脏中影响氨基酸代谢的关键酶之一，S．Ponsuksili等于2005年将此基因定位于猪第7号染色体77cM处，这个位置正好位于一个与脂肪性状有关的QTL区域(75-117cM)及一个与胴体长度有关的QTL(79-126cM)内。本实验在已知其mRNA序列的基础上，利用序列同源性获得了该基因全部共5个内含子序列； (2)在第一内含子第69bp处发现了大白T／梅山G的碱基突变，创建了PCR-AsuC2Ⅰ-RFLP法在大白和梅山2个纯种群体中检测了这个SNP确实存在，并通过计算基因频率和基因型频率分析了此SNP的遗传效应，同时在大白×梅山F_2代146头的资源家系中与猪胴体性状进行了关联分析，发现此突变位点与猪中驱、腰肌的重量以及前驱和后驱的肥、瘦肉的重量，肥肉率，瘦肥比率呈相关显著(p＜0.05)，与前驱和后驱重量以及前驱、中驱、后驱的瘦肉重量，瘦肉率成极显著相关(p＜0.01)。 (3)利用半定量RT-PCR的方法在猪同一生长阶段同一品种的10个不同组织中研究了该基因的组织表达谱，分析发现，该基因在肝脏中表达量最高。 2．GLP-1R(Glucagon-Like Peptide-1，胰高血糖素样肽1受体) (1)能促进胰岛素的分泌、刺激β细胞的增生、介导GLP-1在人类骨骼肌细胞中发挥与胰岛素类似的功能，包括刺激糖元合成、提高糖元合成酶a的活性、促进葡萄糖之氧化和利用、抑制糖元磷酸化等。该基因已经被定位于人染色体的6p21。本实验利用NCBⅠ网站所提供的猪GLP-1R EST序列以及人、鼠该基因的同源性获得了部分编码区序列以及内含子和3′UTL； (2)在第10内含子的第272bp处发现大白C／梅山T的碱基突变，建立了SNP的PCR-Ecol 30Ⅰ-RFLP检测方法，在计算此SNP基因频率及基因型频率的基础上分析了其遗传效应，同时在大白×梅山F_2代135头的资源家系中与猪胴体性状进行了关联分析，发现此突变位点猪与板油重、花油重、肩部最厚处背膘厚、三点平均背膘厚、眼肌高、眼肌宽以及前驱、中驱、后驱的肥肉重呈现显著相关(p＜0.05)，与左片胴体重及肥肉率呈相关极显著(p＜0.01)。 (3)利用实时荧光定量的方法研究了GLP-1R在猪同一生长阶段同一品种的10个不同组织中表达情况，发现其在心、肝、肾等组织中均有表达，在肾脏表达量最高．与人相比，它特别在猪脂肪组织中也有表达。