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胸膜肺炎放线杆菌萘啶酸抗性菌株的选育和信号标签突变株的构建

商霖  
【摘要】: 胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)的病原菌,引起猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成严重的经济损失。该病分最急性、急性和慢性三种:最急性或急性以肺部广泛出血为特征,可造成猪急性死亡;慢性以肺部局灶性坏死和胸膜炎为特征,会导致猪生长缓慢,饲料报酬降低。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。 但由于APP血清型众多,而且各血清型之间交叉保护力较低,再则该病传染性很强,给应用传统疫苗对该病进行免疫预防带来了极大的困难。人们采取了各种灭活疫苗、亚单位疫苗的免疫措施和方法来控制和预防该病,但效果均不是十分理想。因此,迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。而毒力因子的全面鉴定是病原菌致病机理研究和防治产品开发的基础。 信号标签诱变(signature-tagged mutagenesis,STM)技术是由Holden等人于1995年建立的一种鉴定病原菌毒力基因的高通量方法。它是以整个基因组为基础的研究病原体致病机制,可在体内对毒力基因进行高通量筛选的一种新方法。近几年应用该技术已对十多种病原微生物进行了筛选。这些筛选中除了找到已知的毒力基因外,还都鉴定到了未知的毒力因子。 本研究通过体外传代选育出APP血清1型和3型萘啶酸抗性菌株,再以萘啶酸抗性菌株为受体菌,以携带mini-Tn10的标签质粒(pLOF/TAG1-48)的E.coli CC118λpir或Sm17-1λpir为供体菌,在或不在E.coli DH5α(pRK2073)的辅助下,进行三亲本或两亲本接合,通过抗性筛选、PCR和Southern杂交鉴定转座突变株。结果表明:体外萘啶酸加压传代很容易选育出萘啶酸抗性APP菌株,该抗性的产生与DNA促旋酶A亚基基因gyrA的突变有关。在APP与E.coli接合实验中,两亲本接合比三亲本接合操作更简单,效率也较高;APP不同菌株在接合和转座效率上存在很大差异,血清1型菌株高于血清3型菌株,3型标准菌株高于地方分离株JL-03。本研究为APP的STM突变体库的构建与毒力基因的鉴定奠定了基础。


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