胸膜肺炎放线杆菌△apxIC/△apxIIC双基因缺失株的构建及其生物学特性和免疫原性的研究

【摘要】： 猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。 预防和控制该病的主要措施是利用本地主要流行的血清型进行免疫接种。目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌引起的临床症状并降低死亡率，但不能降低发病率、慢性感染和阻止肺部病变，对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。可以说，采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择，迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。与灭活疫苗和亚单位疫苗不同，APP的自然感染或试验感染能够诱导抗任何异源血清型的保护。而且弱毒活疫苗与传统疫苗相比有能够重复提呈抗原和持续性刺激免疫应答的优点。因此通过缺失毒力因子构建弱毒活疫苗已成为国内外疫苗研究的热点。构建APP突变株的传统方法存在很多缺陷。利用化学或转座子介导的突变方法存在随机性，遗传背景不明晰；而通过传统的同源重组方法导致靶基因突变而获得的突变株最后含有抗性标记，由于不符合生物安全性要求不能作为疫苗株用于疫苗生产。 鉴于上述背景，本研究旨在以本地分离APP-1型菌株SLW01为亲本菌，缺失ApxI和ApxⅡ的激活因子apxⅠC和apxⅡC，构建不含抗性标记的APP双基因缺失株，从而发展一个能提供有效的交叉保护效率的无外源基因的安全、廉价的APP弱毒活疫苗菌株来预防和控制猪传染性胸膜肺炎的发生与流行，主要的研究内容包括： 1．基因的克隆与重组自杀性质粒的构建 参照GenBank中apxⅠapxⅡ基因的序列，从SLW01中扩增了apxⅠC和apxⅡC基因的上下游片段。将得到的上下游片段，连接到携带蔗糖敏感基因(SacB)的自杀性质粒pEMOC2上，构建缺失了385 bp的apxⅠC基因的重组自杀性质粒pEM△ⅠC和缺失了340 bp的apxⅡC基因的重组自杀性质粒pEM△ⅡC。 2．接合转移与缺失株SLW02、SLW03的筛选鉴定 以转化了重组自杀性质粒pEM△ⅠC的大肠杆菌β2155为供体菌，APP-1型菌株SLW01为受体菌进行接合转移。涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10％蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性(Cm~R)蔗糖敏感(Sur~s)的接合子，进一步用PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中。鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生。涂布含10％蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感(Cms)蔗糖抗性(Sur~R)的克隆，用进行PCR鉴定，以确定发生了第二次交换，重组自杀性质粒已经丢失。从而构建单基因缺失株SLW02。在单基因缺失株SLW02(△apxⅠC)的基础上，用转化了质粒pEM△ⅡC的大肠杆菌β2155作为供体菌，单基因缺失株SLW02(△apxⅠC)作为受体菌进行接合转移，用同样的方法构建双基因缺失株SLW03(△apxⅠC/△apxⅡC)。 3．缺失株生物学特性的研究 在绵羊血平皿上测定SLW01、SLW02和SLW03的溶血活性，结果显示SLW01具有极强的溶血活性，单基因缺失株SLW02(△apxⅠC)具有较弱的溶血活性，而双基因缺失株SLW03(△apxⅠC/AapxⅡC)则失去了溶血活性。 用Western blot检测双缺失株SLW03和亲本菌SLW01中毒素的分泌情况，结果表明SLW01和SLW03都能够分泌毒素Ⅰ和毒素Ⅱ，说明apxⅠC和apxⅡC基因缺失后，SLW03仍然可以分泌无毒力的毒素。 将缺失株和亲本株都进行活菌计数，绘制生长曲线，结果表明，缺失株SLW02和SLW03与亲本菌比较，生长速度没有明显的变化，说明apxⅠC和apxⅡC的缺失对SLW01的生长无影响。 测定亲本菌和缺失菌在Balb/C小鼠体内的毒力，计算LD_(50)的值。结果显示，与亲本菌SLW01比较，单基因缺失株SLW02(△apxⅠC)的毒力降低了约200倍，双基因缺失株SLW03(△apxⅠC/AapxⅡC)的毒力降低了约2000倍。 4．双基因缺失株SLW03(△apxⅠC/AapxⅡC)对小鼠的免疫试验及攻毒保护试验 将SLW03和1、2、7型三价灭活疫苗分别免疫Balb/C雌鼠，免疫2次，间隔2周。于免疫前、一免后2周和二免后2周分别检测了APP-1 IHA抗体和毒素ELISA抗体水平。结果表明，未免疫组的小鼠在整个试验过程血清抗体均呈阴性。结果显示，SLW03免疫小鼠后不但能够刺激机体产生较高的菌体抗体，而且能够产生较高的毒素抗体。灭活苗免疫组只能产生IHA抗体，不能产生毒素抗体。二免两周后，分别用低剂量(10 LD_(50))和高剂量(100 LD_(50))的同源血清型1型(SLW01)和异源血清型7型(XFNZ)攻毒。对于低剂量的攻毒，SLW03免疫组和灭活疫苗免疫组的小鼠都得到了100％的保护。对于高剂量的攻毒，SLW03对1型的保护率是100％，7型是75％。而灭活疫苗免疫组对1型和7型的高剂量的攻毒的保护率分别为25％和37.5％。所以弱毒菌株SLW03在小鼠中的免疫效力优于传统灭活疫苗。 5．SLW03(△apxⅠC/△apxⅡC)对断奶仔猪的免疫试验及攻毒保护试验 将SLW03分别通过肌肉免疫和鼻内免疫两种途径免疫断奶仔猪，免疫2次，间隔2周。于免疫前、一免后2周和二免后2周分别检测了APP-1 IHA抗体和毒素ELISA抗体水平。结果表明．两个免疫组的IHA抗体和ELISA抗体都显著高于对照组。但第28天，鼻内免疫组的ELISA抗体水平显著高于肌肉免疫组。二免两周后分别用同源血清型(1型)和异源血清型(9型)进行攻毒。结果表明，所有免疫组的猪都得到了100％的保护，对照组的猪并没有产生任何保护。免疫组的猪肺损伤指数和临床症状指数都显著低于未免疫组，相同血清型攻毒的鼻内免疫组的肺损伤指数显著低于肌肉免疫组。所以鼻内免疫途径比肌肉免疫途径好。