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金黄色葡萄球菌耐热核酸酶相关基因的功能与特征分析

唐俊妮  
【摘要】: 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是食品中常见的污染菌且能产生肠毒素,被认为是引起细菌性食物中毒最普遍的原因之一。另外,它还涉及许多感染性疾病,引起感染后可影响到宿主的任何器官,有时甚至是致命的。肠毒素种类繁多,新的血清型,如SEG、SHE、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN和SEO目前还没有商业检测系统可利用。金黄色葡萄球菌耐热核酸酶与肠毒素在食物储存与加工的各种条件下都能保持相似的稳定性,并且耐热核酸酶与肠毒素有很高的符合率,因此可作为金黄色葡萄球菌引起食物中毒的指示剂。另外,金黄色葡萄球菌的许多毒力因子是由双元组份系统来控制的,但精确的调控机制目前知道的仍不多。 本文以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶相关基因为主要研究对象,比较了金黄色葡萄球菌几个株系的生化特性、外蛋白分泌情况及肠毒素的基因类型;建立了检测金黄色葡萄球菌,特别是产肠毒素性金黄色葡萄球菌的双重PCR方法;证实了金黄色葡萄球菌中两个不同基因源核酸酶的共表达现象;探讨了金黄色葡萄球菌两个主要的调控位点agr和sae对耐热核酸酶表达的影响。主要研究内容如下: 1、检测了金黄色葡萄球菌几个株系的生化特性、胞外蛋白的分泌情况和肠毒素的基因类型,以证实金黄色葡萄球菌的基本特性。结果表明:所有菌株都可发酵葡萄糖、蔗糖和甘露糖,菌株S2、26111、S1’、S2’、S3’可分解精氨酸,菌株S6、S2、S1’、S3’尿酶试验显阳性,菌株S2’的H_2S试验呈阳性,菌株26111可分解肌醇和密二糖,菌株26111和S2’可分解山梨醇、苦杏仁苷和阿拉伯糖;菌株S6、S2、S1’和S3’可产生血浆凝固酶、蛋白A、α-溶血素、β-溶血素、耐热核酸酶、肠毒素,及表皮剥脱毒素等,这是它们导致食物中毒或其它疾病的可能原因;根据肠毒素基因的五对特异性引物进行了多重PCR扩增,肠毒素的多重PCR检测验证了胞外分泌蛋白的SDS-PAGE检测,它们具有一致性。 2、比较了金黄色葡萄球菌DNA的四种提取方法,并对方法4进行了改进,用70%的乙醇处理菌细胞使得提取的DNA质量更高;利用新的候选基因nuc2(首次应用)和16S rRNA的保守序列设计了两对特异性引物,耐热核酸酶的分析结果与扩增结果100%符合;灵敏度分析表明检测限是9.35pg/μl金黄色葡萄球菌DNA,对于人工污染牛奶的检测,用PCR直接进行扩增,样品的检测限可以达到10~4~10~5CFU;基于增菌培养,其检测限可达到1CFU;在本研究中应用了均匀设计优化反应条件,双重PCR结果与肠毒素基因的多重PCR检测结果也是100%相吻合,没有出现假阴性或假阳性,建立了一种快速、简易、高效和准确的方法,可以检测所有的金黄色葡萄球菌,同时也能检测出产肠毒素的菌株。 3、检测了不同培养条件对耐热核酸酶活性、金黄色葡萄球菌生物量的影响以及它们之间的相互关系,以探究金黄色葡萄球菌生长的不同微生境对核酸酶分泌的影响。结果表明,pH7.0时菌体生长最好,pH9.0-9.6时核酸酶的活性最强;当菌数达到3.2×10~3 CFU/ml时,已经可以检测到核酸酶活性,对数生长期之后核酸酶活性基本上保持不变:不同浓度NaCl影响下,耐热核酸酶的活性曲线与金黄色葡萄球菌菌体浓度曲线变化趋势较为一致,可能NaCl对耐热核酸酶产生影响较小或无影响;100℃处理55 min时核酸酶活性保持不变,95min时核酸酶活性有所下降,到135min还有很强的活性,证实了耐热核酸酶是一种稳定的蛋白质。 4、目前认为金黄色葡萄球菌的热稳定性核酸酶只源于一个基因编码,即葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase)的编码基因(这里命名为nuc1),但全基因组中发现了另一个新的候选基因nuc(这里命名为nuc2),预测其产物是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase)。为了证实两个基因功能的相关性,选用两个原核表达载体pET-17b和pET-28a,构建了四个重组表达载体pET17-nuc2、pET17-nucl、pET28-nuc2和pET28-nuc1分别对两个不同的核酸酶基因进行了克隆和表达,结果表明四个重组表达蛋白都具有分泌核酸酶的活性;进一步应用生物学软件对SNase和TNase的氨基酸序列进行了比对,这两个不同基因源的酶有较高的相似性,通过比对还发现人们多年来一直研究的SNase A蛋白是来自nuc1基因编码的一部分。 5、为了进一步探讨nuc2基因能否在金黄色葡萄球菌体内表达核酸酶,构建了重组质粒pBT_2Δnuc1并电转入菌株RN4220中,经过七轮培养和筛选,重组几率为2%(7/345)。筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得nuc1基因的缺失突变株RNΔnuc1。生化特性比较结果表明,亲本株和突变株均具有分解核酸的活性,只是突变株的活性明显降低,经过121℃,30 min高压灭菌之后,依旧有酶活,表明两个不同的基因均能表达耐热性核酸酶;进一步检测亲本株和突变株的胞外表达蛋白,二者在18.4 kDa和14.4 kDa附近有区别,突变株在大约16.8 kDa和12.0 kDa附近的两条带消失了,而在大约9 kDa附近多了一条带。互补验证时,构建了互补表达质粒pBT_2-NUC1C,互补表达质粒可大大恢复核酸酶的活性。 6、构建了同源重组穿梭质粒pBT_2Δsae,电转化到金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,在40℃经过七轮培养后,经过抗性培养基筛选、PCR和RT-PCR验证,获得了金黄色葡萄球菌sae基因缺失突变株RNΔsae。比较RNΔsae株及其亲本菌株RN4220、agr位点突变株RN6911和SH1000 1046及其亲本菌株SH1000 682的耐热核酸酶的分泌情况,结果agr位点的缺失对耐热核酸酶活性影响不明显;而sae位点的缺失对耐热核酸酶分泌的影响较大,亲本株RN4220和突变株RNΔsae的胞外分泌蛋白存在着显著区别,有三条带(α-溶血素、β-溶血素、蛋白A)在突变株RNΔsae中明显减弱。


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