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聚γ谷氨酸在枯草芽胞杆菌和大肠杆菌中的生物合成

江昊  
【摘要】: Bacillus subtilis chungkookjang是一株从韩国的传统食品中分离到的聚γ谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)高产菌。该菌株具有产量高、分子量大、不含质粒等特点。本课题以该菌株为出发菌株,利用从该菌株中克隆到的聚γ谷氨酸合成酶基因构建大肠杆菌表达系统,通过高密度发酵,基因芯片分析和代谢通量分析等方法显著提高了大肠杆菌基因工程菌合成聚γ谷氨酸的能力。 通过摇瓶发酵实验发现:B.subtilis chungkookjang的最优液体发酵的配方为32g/L葡萄糖;48g/L甘油;14g/L NH_4Cl:20g/L谷氨酸;1%氯化钠;20mL的装液量,5%接种量,初始pH为7.2;培养温度37℃。在此条件下,γ-PGA的产量可达8.2g/L。 PCR扩增出该菌株的三个聚γ谷氨酸合成酶基因(pgs1,2,3),分别构建了trc诱导型表达质粒pMpgs123和两个组成型表达质粒pCOpgs和pGntpgs。将三个表达质粒分别转入大肠杆菌受体菌XL1-blue、BL21(DE3)、W3110、FMJ123来检验不同表达系统合成聚γ谷氨酸的能力。结果表明,BL21(DE3)-pCOpgs优于其它表达系统,摇瓶发酵的产量为0.51g/L。 BL21(DE3)-pCOpgs的5L发酵罐高密度发酵实验表明,pH恒化补料优于对数补料,在R/2+0.85g/L谷氨酸培养基中,产量可达1.27g/L。 为进一步提高产率,利用DNA-microarray技术分析了大肠杆菌的2850个基因在合成聚γ谷氨酸时转录水平发生的变化:其中196个基因的表达增强,217个基因的表达减弱。谷氨酸代谢相关基因的转录差异表明,大肠杆菌在合成聚γ谷氨酸时,细胞处于氮源缺乏状态。在600g/L葡萄糖的补料培养基中添加40g/L(NH_4)_2SO_4,BL21(DE3)-pCOpgs在pH恒化补料发酵中产量达到3.76g/L。代谢通量分析发现:α-酮戊二酸流向琥珀酰辅酶A的碳通量大于流向谷氨酸的碳通量,这是造成大肠杆菌合成聚γ谷氨酸能力弱的主要原因。


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