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油菜内生枯草芽孢杆菌BY-2的定殖生态、抗菌机制和防治菌核病的研究

江木兰  
【摘要】: 真菌病害是农作物最主要的减产因子,目前采用的化学防治等措施存在着防治成本高、效果不理想和环境污染等问题。利用内生细菌以及枯草芽孢杆菌产生的小分子抗菌肽防治植物病害可克服环境因子影响和病原菌的耐药性,并可获得较稳定的防治效果。 本研究从健康油菜植株组织内分离到具有生物防治作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BY-2。在模拟自然环境的盆栽条件下,接种后10d,BY-2在油菜苗期植株内的定殖菌数达到10~3cfu/g(土壤)以上,至30d菌数仍保持10~3cfu/g以上;该菌还能侵入大豆、玉米、小麦等其它植物组组织内。BY-2是植物内生菌也是植物根际的优势细菌,能够在油菜根际利用其根的分泌物而大量繁殖,接种后10d菌数达10~9/g(土壤)以上;在根表的附着菌数也明显高于植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria, PGPR) Pseudomonus alcaligenes A9。 BY-2对油菜菌核病[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary]、水稻纹枯病菌(Thanatephorous cucumeris (Frank) Donk)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum)等15种农作物主要病害的病原均有抑制作用,主要通过破坏真菌菌丝、抑制菌核萌发、诱导植物抗性以及改良微生态环境,对峙培养的抑菌圈其最大的直径达到Φ=3.7cm。 BY-2对营养的要求简单,生长繁殖速度快,在LB培养液中,28℃下振荡(150r/min)培养48h达到对数生长期,菌数高达10~(10)/mL;培养72h时,抗菌物质产量最高。37℃细菌生长最快,但28℃其抗菌物质产量和活性最高。细菌在pH5-9范围内能正常生长繁殖,pH3环境能够存活但生长缓慢,pH6-7有利菌株生长和代谢;通气量以每容器(250mL)中装120mL液体振荡(150r/min)培养最佳。 BY-2产生2种类型的抗真菌物质,一种是挥发性抗菌物质,可以抑制真菌生长;另一种是细胞外分泌型抗菌物质。细胞外分泌型抗菌物质为该菌的主要抗菌物质,通过调节发酵溶液至酸性收集沉淀,再用甲醇溶解提取得到的抗菌物质,对油菜菌核病的抑菌效果与原发酵液相同。 采用甲醇二次溶解及Sephadex G25葡聚糖凝胶层析柱分离,可以将胞外分泌型抗菌物质纯化,纯化物经高效液相色谱仪(HPLC)测定,在甲醇:水的流动相条件下,1.969min出现峰值19mAU,其它成分极少,仅在9.5min后出现极少混杂物质峰。改变HPLC流动相为三氟乙酸:甲醇,在甲醇:水的流动相条件下1.969rain出现的样品峰分离为6个峰值,用电离喷雾质谱分析,其分子量分别为995Da、1009Da、1023Da、1037Da、1051Da和1087 Da。纯化物的氨基酸组成及比例为:天冬氨酸:谷氨酸:缬氨酸:亮氨酸=1:1:1:1.5。根据纯化物的氨基酸组成和分子量等特征进行综合分析,表明该物质与脂肽类抗生素(lipopeptide)中的表面活性剂Surfactin相似,但氨基酸的比例与已报道的有差异,1051Da和1087Da 2个大分子同系物尚未见报道。这些脂肽抗生素具有耐高温、抗紫外线、广谱的pH有效性、在有机溶剂中的稳定性和长时间保持有效性的特点。 研究结果表明,BY-2以及产生的脂肽抗生素都可以有效防治多种真菌病害。油菜离体叶片上对菌核病的防治率为100%,盆栽条件减少油菜叶片发病率86.4%,大田油菜枯杆率显著低于对照。对向日葵、大豆等多种作物菌核病和水稻纹枯病(Thanatephorous cucumeris(Frank)Donk)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)等也都有良好的防治效果。


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