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苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种菌株YBT-1765的质粒研究

黄军艳  
【摘要】: 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株YBT-1765是从粮食仓库中分离得到的一株拟步行甲亚种(subsp.tenebrionis,H_(8ab))菌株。该菌株至少含有三个内生质粒,本文对其可检测到的最大质粒pBMB165的复制区和最小质粒pBMB175的研究结果如下: 1.质粒pBMB165复制子的研究 克隆并分析了包含质粒pBMB165复制子的一个20kb的DNA片段(GenBank登录号为:DQ242517)。通过缺失实验,将质粒pBMB165的复制子缩短到一个3.6kb的片段上。同时证明,质粒编码的复制蛋白Rep165和两个顺式作用因子(复制起点ori165和重复子iterons区域)为质粒复制必需因子。还发现了两个重叠的开放阅读框:ORF6和ORF10,能参与控制质粒稳定性,为质粒稳定遗传必需因子。这是首例报道的来源于拟步行甲亚种质粒复制子。 通过序列分析,质粒pBMB165复制子与θ复制pAMβ1家族质粒的复制子具有同源性,该质粒也应属于pAMβ1质粒家族。此外,芽胞杆菌群中pAMβ1家族质粒(pBMB165,pBT9727,pAW63和pXO2)复制区之间还表现出结构组成的相似性,但是与其它细菌中的pAMβ1家族质粒复制子的结构组成不同,表现出该家族质粒复制子的遗传可变性。 另一方面,在质粒pBMB165复制子相邻区域含有五个可能的转座因子。其中,IS231U为一种新的IS231类插入序列;根据序列的相似性,ISBth165、ISBth166和ISBth167分别属于IS5、IS110和IS3家族转座因子;TnBMB165是一个不完整的Ⅱ型转座子。这些转座因子的存在,可能引起遗传物质的交换和重组,从而导致质粒或质粒复制子的进化,为研究pAMβ1质粒家族质粒及其复制子的进化提供了有用的遗传信息。 2.菌株YBT-1765消除质粒突变株的筛选 将出发菌株YBT-1765采用逐级升温培养以及十二烷基磺酸钠(SDS)处理的方法,筛选得到两株质粒部分消除突变株,其中,突变株BMB193消除了YBT-1765中可检测的最大质粒pBMB165;突变株BMB175则只含有出发菌株中的最小质粒pBMB175。 3.质粒pBMB175的克隆和分析 克隆得到菌株YBT-1765中大小为14,841bp的最小质粒pBMB175(GenBank登录号为:DQ364061)。序列分析表明,pBMB175含有18个ORFs(大于70个氨基酸)。其中,8个ORFs(编码假定蛋白)与苏云金亚种(subsp.thuringiensis)滚环复制质粒pG13的ORFs有不同程度的同源性。 通过缺失分析,将质粒pBMB175复制子定位在1,151bp的XbaI-ClaI片段上,该复制子只含有一个完整的ORF(ORF7),且为复制所必需。数据库搜索表明,ORF7的编码产物与任何已知蛋白没有显著的序列相似性,从而推测,ORF7可能编码一种新的复制蛋白。通过核苷酸序列二级结构分析,预测了pBMB175可能的双链复制起点(dso)区域,该质粒可能的dso区与其它滚环复制质粒的dso区没有同源关系。因此,pBMB175可能属于一类新的质粒家族。


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