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石菖蒲根茎提取物有效杀虫成分分析

黄衍章  
【摘要】: 粮食仓储工作是我国粮食工作的重点,而如何有效地防治储粮害虫又是粮食仓储工作的关键。植物源农药属绿色无公害农药,对害虫不易产生抗药性,符合可持续农业发展的客观要求。玉米象、谷蠹、赤拟谷盗是我国的三种主要储粮害虫,其中玉米象已被国内粮食部门列为储粮头号害虫,谷蠹则为南方储藏谷物的重要害虫,在我国已对磷化氢等化学杀虫剂产生了严重的抗药性。至此,本研究得到了国家十五科技重点攻关项目“植物杀虫剂在储粮害虫防治中的应用与示范”(2004BA523803-2)的有力资助。 1石菖蒲根茎提取物有效杀虫成分的分离与鉴定 1.1石菖蒲根茎提取物有效杀虫成分的分离 采用甲醇冷浸法和有机溶剂萃取法,对石菖蒲新鲜根茎干粉进行了提取和初步分离。结果表明:甲醇对石菖蒲根茎干粉具有较高的提取率,浓缩后提取物得率为19.2%。石油醚萃取物浓缩后得率为23.5%。 采用硅胶柱层析法,以碘蒸气为显色剂,对石油醚萃取物有效杀虫成分逐步进行初分和细分,浓缩后得到三种活性组分。选取活性最好的两种组分用硅胶柱层析法进行纯化,得到两种浅黄色油状活性单体。 1.2石菖蒲根茎提取物各分离组分对试虫的初步毒效 采用药膜法,以玉米象、谷蠹、赤拟谷盗为试虫,研究了石菖蒲根茎提取物各分离组分对试虫的初步毒效,结果表明: 石菖蒲根茎提取物四种溶剂萃取物以石油醚萃取层的生物活性最高。药膜法314.40μg/cm~2密闭处理72h后,石油醚萃取物对玉米象、谷蠹和赤拟谷盗的校正死亡率均为100.00%。水萃取物也具有一定的毒杀活性,对谷蠹和赤拟谷盗以314.40μg/cm~2密闭处理72 h后的校正死亡率分别为88.51%和56.98%。 将初分馏分用157.20μg/cm~2剂量进行生物测定,结果表明活性馏分为极性较低的化合物。8种洗脱馏分以61~72号洗脱馏分的毒杀活性最高,处理72h后对三种试虫的校正死亡率均高于80.00%,显著高于其余7种洗脱馏分。将细分馏分用157.20μg/cm~2剂量进行活性测定,结果表明组分Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ对试虫具有较高的毒杀活性,处理72h后对玉米象的校正死亡率依次为81.11%、97.78%、100.00%,对谷蠹的校正死亡率分别为57.78%、97.78%、97.78%。组分Ⅲ、Ⅵ用157.20μg/cm~2剂量处理72h后对赤拟谷盗的校正死亡率均为100.00%。 采用药膜法对三种优选组分进一步进行初步毒效测定,结果表明组分Ⅲ、Ⅵ对试虫具有较好的毒杀效果。组分Ⅲ对试虫的毒杀效果比较缓慢,其毒效与处理时间关系密切。组分Ⅲ对谷蠹和赤拟谷盗具有较好的生物活性,用39.30μg/cm~2剂量处理72h后的校正死亡率分别为64.44%和90.00%。组分Ⅵ对玉米象和谷蠹具有较高的毒效,19.65μg/cm~2剂量处理72h后的校正死亡率分别为54.44%和87.78%。1.3石菖蒲根茎提取优选组分有效成分初步分析 采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS),对石菖蒲根茎提取三种优选活性组分的有效成分进行了初步分析。 在组分Ⅱ中,化合物1~2的分子量均约为205,且互为同分异构体。化合物3~5的分子量均约为220,也互为同分异构体。初步推断组分Ⅱ主要由5种倍半萜类化合物组成。在组分Ⅲ中,化合物7为主要活性成分,分子量为218。在组分Ⅵ中,初步推断化合物8为榄香素(1,2,3-trimethoxy-5-(2-propenyl)benzene),化合物9为β-细辛醚(cis-1,2,4-trimethoxy-5-(1-propenyl)benzene),化合物9为组分Ⅵ的主要活性成分。 1.4石菖蒲根茎提取活性单体结构鉴定 1.4.1化合物7结构鉴定 质谱鉴定结果表明:单体7为愈创烷型倍半萜,分子量为218,可能含有CH_3-,>CHCH_2-,>C=O片段。紫外吸收光谱鉴定结果表明:单体7中含有共轭双键(-C=C-C=C-)或类似键结构。红外吸收光谱鉴定结果表明,单体7中含有>C=O和不饱和的共轭酰基碳结构(-C=C-C=O)。~1HNMR鉴定结果表明单体7中含有2个CH_3-CH<片段,2个烯甲基(CH_3-C=C),2个烯丙基结构(-C=C-CH_2-C=C-),且存在-CH_2-CO-片段,不含-CH=CH-结构。~(13)CNMR鉴定结果显示单体7中含有1个>C=O,2个>C=C<。 综合分析各光谱特征,确定单体7为一种已知的倍半萜类化合物菖蒲烯酮(3,8-二甲基-5-(1-甲基乙叉基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢奠-6-酮)。 1.4.2化合物9结构鉴定 质谱鉴定结果表明,单体9与β-asarone有很大的匹配度,含有CH_3-和CH_3CH=片段,分子量为208。紫外吸收光谱鉴定结果表明,单体9与标准品β-asarone均含有1个双键与苯环共轭。红外吸收光谱鉴定结果表明,单体9含有-CH=CH-,CH_3O-及苯环。~1HNMR鉴定结果显示单体9含有1个CH_3-CH=结构,3个CH_3O-,CH_3CH=CH-基团,-CH=CH-C=基团且苯环上共有2个H。~(13)CNMR鉴定结果表明单体9苯环上有3个H被甲氧基所取代,且含有CH_3-与-CH=CH-相连。 综合分析各光谱特征,确定化合物9为一种已知的苯丙素类化合物β-细辛醚(1,2,4-三甲氧基-5-(1-Z-丙烯基)苯)。 2石菖蒲根茎浸膏石油醚萃取物,β-细辛醚和菖蒲烯酮对试虫的生物活性 2.1石菖蒲根茎浸膏石油醚萃取物对试虫的生物活性 药膜法测定结果表明:石油醚萃取物对谷蠹和玉米象具有较高的触杀活性。用39.30μg/cm~2剂量处理72h后对谷蠹的校正死亡率为88.37%。石油醚萃取物对谷蠹、玉米象、赤拟谷盗的LD_(50)(72h)依次为8.85、40.04、64.88μg/cm~2。三角瓶药纸熏蒸试验结果表明:石油醚萃取物对谷蠹具有较高的熏蒸活性,随着处理时间的延长,对谷蠹的熏杀效果显著加强,25μL/L与100μL/L熏蒸处理120h后对谷蠹的校正死亡率无显著差异。石油醚萃取物对玉米象具有一定的熏蒸活性,100μL/L熏蒸处理120h后对玉米象的校正死亡率为83.30%。滤纸药膜选择法测试结果表明:石油醚萃取物对赤拟谷盗具有很高的驱避效应,各剂量处理72h三次调查的平均驱避率均为Ⅴ级水平。石油醚萃取物对玉米象和谷蠹具有一定的驱避活性,用157.20μg/cm~2剂量处理72h的平均驱避率均为Ⅳ级水平。 粮食拌药法试验结果表明:石油醚萃取物对谷蠹和玉米象具有较好的种群抑制活性和防治效果,对谷蠹兼具较高的毒杀作用。用250mg/Kg剂量处理3d后对谷蠹的毒杀率为97.73%,显著高于5mg/Kg马拉硫磷处理,对小麦的防效达100.00%,与5mg/Kg马拉硫磷处理相当;125mg/Kg剂量处理对谷蠹子代种群的抑制率为96.47%,与5mg/Kg马拉硫磷处理没有显著差异。 2.2石菖蒲根茎提取β-细辛醚对试虫的生物活性 β-细辛醚对玉米象和谷蠹具有较高的触杀活性,药膜法处理72h后的LD_(50)分别为51.29μg/cm~2和30.27μg/cm~2。β-细辛醚对谷蠹具有很高的熏蒸活性,25μL/L熏蒸处理120h后的校正死亡率为97.93%,与100μL/L处理无显著差异。β-细辛醚对谷蠹的熏杀效果比较缓慢,延长熏蒸时间可显著提高熏杀效果。β-细辛醚对玉米象具有较高的熏蒸活性,25μL/L熏蒸处理120h后的校正死亡率为89.81%。β-细辛醚对赤拟谷盗具有很高的驱避活性,各剂量处理72h三次调查的平均驱避率均≥Ⅳ级水平。 β-细辛醚对玉米象和谷蠹具有较好的毒杀活性、种群抑制作用和防治效果。200mg/Kg剂量处理3d后对谷蠹的毒杀率为99.00%,显著高于5mg/Kg马拉硫磷处理,100mg/Kg处理对谷蠹子代种群的抑制率为85.25%,对小麦的防效可达90.35%,与5mg/Kg马拉硫磷处理没有显著差异。250mg/Kg剂量处理后对玉米象子代种群的抑制率和小麦的防效分别为98.82%和88.08%,与5mg/Kg马拉硫磷处理效果相当。2.3石菖蒲根茎提取菖蒲烯酮对试虫的生物活性 菖蒲烯酮对玉米象和谷蠹具有一定的触杀活性。药膜法处理72h时的LD_(50)分别为61.84μg/cm~2和71.34μg/cm~2。菖蒲烯酮对玉米象和谷蠹具有较好的熏蒸活性,166.67μL/浓度处理120h后的校正死亡率分别为72.52%和86.43%。菖蒲烯酮对谷蠹的熏蒸效果比较缓慢,随着熏蒸时间的延长,对谷蠹的熏杀作用显著加强。菖蒲烯酮对赤拟谷盗具有很高的驱避效应,19.65μg/cm~2剂量处理72h三次调查的平均驱避率为Ⅴ级水平。 菖蒲烯酮对谷蠹具有较好的毒杀活性、种群抑制作用和防治效果。用500mg/Kg剂量处理3d后对谷蠹的毒杀率为94.47%,与10mg/Kg马拉硫磷处理无显著差异。250mg/Kg剂量处理后对谷蠹子代种群的抑制率为98.70%,与10mg/Kg马拉硫磷处理效果相当,125mg/Kg剂量处理后对小麦的防效为100.00%,与10mg/Kg马拉硫磷处理无显著差异。 2.4β-细辛醚和菖蒲烯酮对试虫的联合毒力 药膜法测试结果表明:β-细辛醚和菖蒲烯酮混用对玉米象和谷蠹成虫具有一定的增效作用。随着β-细辛醚含量的增加,对谷蠹的增效作用逐步增强。当β-细辛醚和菖蒲烯酮按4:1(W/W)混用时,对谷蠹的共毒系数为127.53(>120),表现为显著的增效作用。β-细辛醚和菖蒲烯酮按1:1(W/W)混用时,对玉米象表现为显著的拮抗作用,其共毒系数为69.42(<80),当β-细辛醚和菖蒲烯酮按2:1(W/W)混用时,其共毒系数为142.33,对玉米象具有显著的增效作用。 3β-细辛醚对玉米象和谷蠹的杀虫机理 3.1对玉米象成虫的杀虫机理 用β-细辛醚LD_(50)(485.00mg/Kg)剂量拌粮处理试虫后,对乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶的活性整体表现为抑制作用,并且在处理24h时的酶活力最低。随着处理时间的延长,β-细辛醚对羧酸酯酶的诱导作用有所加强。β-细辛醚不同处理时间对试虫的酯酶同工酶具有一定的影响,处理12h时酯酶E4、E5的表达量有所降低,36h后酯酶E1、E2、E3的表达量则有所增加。 用不同剂量的β-细辛醚处理试虫,结果表明低剂量(≤250.00mg/Kg)的β-细辛醚处理对乙酰胆碱酯酶具有诱导作用,高剂量(≥500.00 mg/Kg)处理对乙酰胆碱酯酶则表现为抑制作用。β-细辛醚对谷胱甘肽S-转移酶具有抑制作用,但抑制效果与处理剂量关系并不密切。随着β-细辛醚处理剂量的增高,羧酸酯酶的活力显著升高。提高β-细辛醚的处理剂量对酯酶E5的抑制作用有所增强。3.2β-细辛醚对谷蠹成虫的杀虫机理 用β-细辛醚LD_(50)(94.49mg/Kg)剂量处理试虫,12h时乙酰胆碱酯酶活性被诱导,24h后主要表现为抑制作用。β-细辛醚对谷胱甘肽S-转移酶的时间效应并不明显,对酯酶同工酶具有一定的诱导作用,诱导效果与处理时间有一定的关系,处理12h后酯酶E4被明显诱导。 低剂量(67.5mg/Kg)的β-细辛醚对乙酰胆碱酯酶具有显著的诱导作用,随着处理剂量的升高,对乙酰胆碱酯酶的活力多数表现为抑制作用。低剂量(≤100.0mg/Kg)的β-细辛醚对谷胱甘肽S-转移酶具有诱导作用,而高剂量(≥133.3mg/Kg)的β-细辛醚对谷胱甘肽S-转移酶具有抑制作用。β-细辛醚对羧酸酯酶的活性多数表现为诱导作用,提高β-细辛醚的处理剂量可提高羧酸酯酶的活力。不同剂量的β-细辛醚处理对谷蠹酯酶同工酶均具有显著的诱导作用,但诱导效果与处理剂量关系并不密切。


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