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胰岛素样生长因子-Ⅰ在奶牛骨代谢病中的作用及机制

李素华  
【摘要】:奶牛骨代谢性疾病(bone metabolic disease,BMD)是包括软骨症、佝偻病、产后瘫痪、产褥热等一系列由钙磷代谢紊乱引起的营养代谢病。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)-I是骨骼生长和矿化中钙磷代谢调节的关键因子,人类临床研究表明其与骨代谢性疾病密切相关。本研究从下述四个方面探讨IGF-I对奶牛骨代谢病中的影响及其机制。 1.奶牛血浆IGF-I的测定及其与骨代谢相关因子的关系 设计了三个独立的试验以探讨IGF-I与奶牛钙磷代谢相关因子的关系。试验I检测不同泌乳阶段钙、磷、IGF-I、甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)、降钙素(calcitionin,CT)等骨代谢相关因子水平,试验Ⅱ检测不同年龄奶牛骨代谢相关因子水平,试验Ⅲ检测奶牛骨代谢病与相关因子的关系。结果显示,奶牛年龄、妊娠状况及血浆IGF-I、PTH、CT水平与机体钙磷水平密切相关,血浆Ca、IGF-I、P、ALP、PTH水平与骨代谢性疾病相关,此外IGF-I与Ca、P正相关(r=0.390,P=0.049;r=0.359,P=0.044),PTH负相关(r=—0.790,P=0.002)。提示IGF-I与奶牛钙磷代谢密切相关,可以作为诊断奶牛骨代谢病的特异生化标志物。 2.奶牛成骨细胞的体外培养、鉴定及生物特性研究 采用胰蛋白酶-组织块移性法获取的细胞具有典型的成骨细胞形态和特性:ALP染色呈阳性,活性水平较高;培养7d后可检测到OC mRNA表达,12d后细胞上清液中可检测到OC蛋白;诱导培养2w后细胞可形成钙化结节。提示本实验室建立的方法所培养的细胞具有成骨细胞特性,可获得高纯度、高活性的奶牛成骨细胞。 3.IGF-I对奶牛成骨细胞增殖、分化、矿化及重建的影响 研究外源性IGF-I对体外培养的奶牛成骨细胞增殖、分化、矿化及重建的影响。结果显示,1-200ng/mL IGF-I均能促进奶牛成骨细胞增殖,100ng/mL组具有最大刺激效应,且IGF-I干预组细胞光密度值(optical density value,OD)从第1d到第5d逐渐增加,第7d降低。与对照组相比,10ng/mL与100ng/mL IGF-I均可显著诱导ALP活性、OC水平以及基质钙含量,钙化结节数量增加20%-180%(P<0.05或P<0.01)。半定量RT-PCR结果显示:10、50、100ng/mL IGF-I干预5d OPG/β-actin、RANKL/β-actin比值显著高于0ng/mL组(P<0.05);ELISA显示,在1-100ng/mL浓度范围内,IGF-I呈剂量依赖方式上调OPG蛋白表达,其中10、50、100ng/mL干预组与0ng/mL组差异显著(P<0.05)。提示IGF-I是奶牛成骨细胞增殖、分化以、矿化及重建的代谢促进剂,这可能是IGF-I参与奶牛骨代谢性疾病的重要机制之一。 4.IGF-I抑制血清饥饿诱导的奶牛成骨细胞凋亡 研究血清饥饿对奶牛成骨细胞凋亡的诱导作用,并探讨IGF-I对血清饥饿诱导的奶牛成骨细胞的影响。结果显示,10~(-3) M脱氧胸苷存在时,血清饥饿2d,MTT法检测到细胞存活率为50%,经琼脂糖凝胶电泳可见梯形凋亡条带。流式细胞术分析显示,与血清饥饿组相比,100ng/mL IGF-I显著增高奶牛成骨细胞的增殖指数,降低其凋亡率(P<0.01)。Caspase-3检测结果显示IGF-I显著抑制csspsse-3的活性(P<0.05)。结果提示血清饥饿可诱导奶牛成骨细胞凋亡,IGF-I抑制这种凋亡诱导作用。


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