猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的表达研究及其单克隆抗体的制备

【摘要】： 猪瘟(classical swine fever;CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus;CSFV)引起的猪的一种高度接触性、急性传染病,以发热和出血为主要特征。CSFV囊膜糖蛋白E2含有A、B、C、D四个抗原结构域,是其最主要的保护性抗原,它能够诱导机体产生中和抗体,并保护猪抵抗强毒的攻击。E2最易变异,是CSFV三种糖蛋白中保守性最低的蛋白,常用于基因工程疫苗和鉴别诊断的靶目标,一直都是CSFV研究的热点。本研究中分别采用原核表达系统和杆状病毒表达系统对E2蛋白进行了表达,并制备了3株抗CSFV E2蛋白的单克隆抗体,为猪瘟病原快速诊断方法的建立奠定了基础。 1.CSFV E2蛋白在原核和杆状病毒系统中的表达研究 我们首先分析CSFV E2蛋白的特性,选择用原核表达系统表达E2基因的不同抗原表位区。根据E2基因序列,设计并合成2对引物,分别用于扩增E2基因ABCD抗原区和AD抗原区。将扩增得到的不同E2基因的片段克隆至pMD18-T载体中,获得pT-E2/ABCD和pT-E2/AD重组质粒。经核苷酸序列测定,E2基因ABCD抗原区和AD抗原区分别长645bp和300bp,编码215个氨基酸和100个氨基酸。将得到的不同抗原区基因片段克隆至pGEX-KG表达载体中获得了重组表达载体pKGE2ABCD和pKGE2AD,与载体GST蛋白形成融合表达蛋白。经鉴定后,转化大肠杆菌BL21-condonplus-RIL感受态细胞,IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达蛋白为融合蛋白,分子量分别约为50kDa和36kDa,表达产物主要以包涵体的形式存在;Western blot检测表明,表达产物能与CSFV阳性血清发生特异性反应,具有良好的生物学活性。 杆状病毒表达系统常用于外源病毒蛋白的表达,表达的蛋白能够保持良好的抗原性。在本研究中,我们选择杆状病毒Bac to Bac表达系统。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pT-E2,回收E2片段,克隆至pFastBac-HT载体中构建了pFastBac-E2;转化DH10Bac感受态细胞并在菌体中发生转座,构建了重组杆状病毒穿梭表达载体Bacmid-E2,经PCR鉴定证实E2基因成功整合到了杆状病毒基因组。最后转染Bacmid-E2到SF-9细胞,获得重组杆状病毒,连续扩大病毒3代后用于蛋白表达。间接免疫荧光结果显示感染重组杆状病毒的sf9昆虫细胞可以发荧光,但反应不强,目的蛋白表达量太低,不能用于后续研究。 2.猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备 将上述原核表达的蛋白纯化后,免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA法进行筛选,采用有限稀释法对其进行克隆,经过3次融合共获得3株能稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为4H5、1C7和4H4。其中4H5和1C7株为针对E2 ABCD表位单克隆抗体,4H4为针对E2 AD表位单克隆抗体。细胞上清和腹水的效价分别为0.4×10~3、0.8×10~3、0.4×10~3和0.2×10~6、0.5×10~5、0.4×10~6,抗体类型为IgG2a、IgG2b和IgG1。间接免疫荧光试验显示3株单克隆抗体都可以和CSFV发生特异性结合,其中4H5和4H4和病毒的反应强于1C7。Western blot检测结果表明,4H5和4H4均可以和CSFV发生反应。