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鸭疫里氏杆菌体内诱导抗原基因的筛选与应用研究

陈芬芬  
【摘要】: 鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anantipestifer,RA)引起的一种高致病性、接触性传染病,呈急性或慢性败血症,主要病理变化表现为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪型输卵管炎和脑膜炎。常给养鸭业造成巨大的经济损失,并呈世界性分布,是危害养鸭业的主要传染病之一。目前对RA的毒力因子和致病机理知之甚少。 病原菌感染机体后体内诱导表达的抗原通常与病原菌的致病机制密切相关。为了研究RA感染机体过程中存在的致病因子,本研究提取了I型RA云梦株的基因组,用限制性内切酶Sau3AI酶切并回收1~4Kb的片段,将酶切回收片段与用BamHI酶切的表达载体pET28a/b/c连接后,转化大肠杆菌BL21,成功构建了RA基因组文库,库容量约3×10~4个。用经体外培养的RA和BL21吸附后的感染鸭血清做探针,通过体内诱导抗原技术,筛选RA的基因组表达文库,得到了28个阳性克隆,它们可能为RA在感染鸭体内诱导表达的新基因,通过生物信息学软件对这些新基因的功能进行了预测和分类,涉及RA生物合成和代谢、信号转导、分泌途径、毒力质粒等方面,这些基因可能编码与RA感染密切相关的蛋白质。本研究为RA致病机制的研究、新疫苗和诊断试剂的开发提供了一种新方法。 设计引物并成功扩增了ive-1、ive-2、ive-6等3个新基因,大小分别为:537bp、1062bp和933bp,对它们进行测序、推导氨基酸序列、分析其抗原性和二级结构。并将每个克隆连接到pGEX-KG载体构建原核表达质粒,用IPTG成功诱导了各个抗原在大肠杆菌BL21中的高效表达,重组蛋白的分子量大小分别为46KDa、66KDa、60KDa。同时用吸附过的感染血清作探针,对这3个新蛋白进行了免疫学活性研究,结果显示它们具有良好的免疫学活性,初步确证这些蛋白为RA感染过程中诱导表达的抗原基因,对RA感染的致病机制研究有重要意义。 以纯化的两个抗原蛋白Ive-2、Ive-6为包被抗原,成功建立了两个间接ELISA方法,结果表明它们均具有良好的重复性、特异性和敏感性。两个间接ELISA对早期感染血清和灭活苗免疫血清的检测结果进一步证实Ive-2是感染早期体内特异性表达的抗原,为以后建立一种RA感染的早期鉴别诊断方法奠定基础。


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