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二化螟诱导水稻表达的基因及二化螟特异诱导水稻启动子的克隆

华红霞  
【摘要】: 二化螟(Chilo suppressalis)是一种为害严重的世界性水稻害虫,目前还未见水稻对二化螟防御反应分子机制、水稻被二化螟取食特异诱导表达启动子研究的报道。本研究的目的在于:将扣除杂交技术和cDNA点阵技术相结合,得到水稻被二化螟诱导表达的基因,推测水稻对二化螟防御反应分子机制,克隆并鉴定水稻被二化螟特异诱导表达的启动子。 将水稻被二化螟取食后叶鞘mRNA及对照mRNA分别作为tester和driver构建cDNA扣除文库,文库Ⅰ以二化螟取食后叶鞘mRNA为tester,以对照mRNA为driver,文库Ⅱ刚好相反。理论上,来自于文库Ⅰ的EST为二化螟诱导上升表达的基因,来自于文库Ⅱ的EST为二化螟诱导下降表达的基因。从两个文库中共挑取864个克隆测序,序列拚接后得到271条unisequence。通过BLASTN和BLASTX分析这些序列的功能,结果表明这些基因涉及到光合作用、基础代谢、次生代谢、信号传导、蛋白降解、电子传递等多个代谢途径,这说明水稻对二化螟的防御反应是一个全基因组水平转录调整过程。 将这271个cDNA克隆、来自于本室明恢63全生育期平衡化cDNA文库的113个克隆、阳性对照及阴性对照cDNA克隆抽提质粒点在尼龙膜上,将二化螟取食后6h明恢63叶鞘及对照叶鞘总RNA反转录并用~(32)P标记成探针与尼龙膜杂交,杂交重复2次。结果得到在两次杂交中皆上升表达的基因12个,在两次杂交中皆下降表达的基因5个。尼龙膜杂交得到的差异表达克隆大大少于扣除杂交得到的差异表达克隆,但在这17个差异表达的克隆中,上升表达的基因基本上来自于文库Ⅰ(1个例外),下降表达的基因基本上来自于文库Ⅱ(1个例外),这说明扣除杂交技术与cDNA点阵技术之间的主要差异在于两者的灵敏度不同。 为了得到二化螟特异诱导表达的水稻启动子,从以上17个差异表达克隆中随机挑取4个上升表达克隆进行Northern blot分析。其中3个克隆同时被机械损伤和二化螟取食诱导。1个可能编码胰凝乳蛋白酶抑制剂的克隆—B1-A04在二化螟取食后急剧上升表达,但是机械损伤处理时其表达量几乎与对照一样,没有明显的变化。 通过PCR从基因组中克隆了B1-A04基因的启动子片段,如果将转录起始位点定位为1,则该启动子片段覆盖了-1569至+446之间的区域,包括B1-A04基因部分编码序列。将该片段(为了描述方便,命名为-1569)与GUS报告基因融合并通过农杆菌转化到水稻品种中花11中。在转基因植株中,二化螟未取食时,GUS基因在茎杆与幼穗中表达,在叶片与叶鞘中不表达;二化螟取食6h后,GUS基因在叶鞘与茎杆中的表达活性明显上升,但是叶片中仍然不表达。这说明该启动子具有器官特异表达、发育阶段特异表达的特点。GUS基因及内源B1-A04基因的表达水平在外源茉莉酸、脱落酸处理前后没有明显的变化。 为了了解-1569片段可能的调控区域,本研究从-1569的5'-end进行缺失,得到-1166至+446(命名为-1166)、-582至+446(命名为-582)、-371至+446(命名为-371)、-112至+446(命名为-112)4个截短的启动子片段。通过GUS活性测定及GUS组织染色可知在-1569位点至-1166位点、-1166位点至-582位点之间存在负调控顺式因子,在未被二化螟取食时抑制GUS基因在叶鞘中表达,被二化螟取食后开放。凝胶阻滞试验(EMSA)鉴定出7个与对照叶鞘核蛋白、二化螟取食后叶鞘核蛋白、机械损伤叶鞘核蛋白结合能力有差异的DNA探针,本文对这7段DNA对下游基因的可能调控作用进行了讨论。 本研究中得到的-1569启动子片段在水稻转基因育种中具有应用前景。


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