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枯草芽胞杆菌B6-1产脂肽和聚-γ-谷氨酸及抗几种植物病原菌的研究

王启军  
【摘要】: 本文首次从作物根际土壤中分离、筛选出对几种作物病原菌具有稳定拮抗作用并产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌B6-1,对菌种进行鉴定,确定其拮抗谱,分离、纯化并鉴定抗菌物质,用红薯渣和豆渣作为固态发酵的主要基质,获得同时高产拮抗物质和聚-γ-谷氨酸,并对该固态发酵产物的生防和肥料增效作用进行了评价。结果如下: 1.运用先富集再加热的方法,从作物根际土壤中分离得到313株芽胞杆菌。平板共培养筛选到37株对至少一种指示病原真菌表现出稳定的拮抗效果。其中菌株B6-1表现拮抗谱最广、拮抗能力最强。根据其生理生化特征和16S rDNA序列分析,被确定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。 2.菌株B6-1产抗真菌活性物质。其发酵液具有油取代、液滴坍塌、红细胞溶血、水溶液中分子之间发生凝聚等典型的表面活性剂特性。所产拮抗物质能被酸沉淀,并能抵抗一定的高温、较宽的pH范围和紫外等条件。以上特性说明枯草芽胞杆菌菌株B6-1所产的拮抗物质应该属于脂肽类抗生素。 3.采用超滤、酸沉淀、固相萃取相结合的方法来分离纯化菌株B6-1所产的抗生素。经过高效液相色谱(HPLC)分部收集并检测各峰拮抗活性,再经过LC-MS分析,主要活性物质的分子量分别为1450、1464、1478、1506,它们之间分子量差异为14的整数倍,即(CH_2)_n。部分分子量与已经报道的C15、C16、C17、C19脂肽类表面活性剂抗生素fengycins相吻合,但其拮抗谱不同,而且fengycins不具备溶血活性,所以可能还存在其它具溶血活性的脂肽。该fengycins具体的结构还有待进一步工作确定。 4.在NB液体培养基发酵中,B6-1产生脂肽抗生素却不产γ-PGA,而在经过优化的高产γ-PGA的液体培养基中,γ-PGA的产量达到34.7 g/L,却不能检测到脂肽抗生素。采用红薯渣、豆渣作主要基质的固态发酵,γ-PGA的产量达到36.3g/(kg干物质)。同时脂肽抗生素的相对产量达到70个单位,而NB液体发酵中为20个单位。同时证实γ-PGA无抗菌活性。 5.当施用B6-1采用红薯渣、豆渣作主要基质的固态发酵产物后,黄瓜枯萎病发病率降低至17%。在全营养水平下,添加B6-1的高产γ-PGA的固态发酵产物时,地下、地上部分干重和根冠比分别为0.447 g、2.448 g、0.183,而对照组分别为0.334 g、2.183g、0.153,地下、地上部分干重和根冠比各自分别比对照增加33.8%、12.2%、18.3%。在1/2营养水平下,添加B6-1的高产γ-PGA的固态发酵产物时,地下、地上部分干重和根冠比分别为0.339 g、1.405 g、0.242,而对照组分别为0.230 g、1.111 g、0.201,地下、地上部分干重和根冠比各自分别比对照增加47.4%、26.4%、20.4%。在1/3营养水平下,添加B6-1的高产γ-PGA的固态发酵产物时,地下、地上部分干重和根冠比分别为0.344 g、0.956 g、0.351,而对照组分别为0.203 g、0.814 g、0.251。结果说明,在各肥料水平下,根部、地上部干重和根冠比都较对照增加,随着肥料水平的下降,根部、地上部干重和根冠比较对照的增加幅度提高,特别是在低肥料浓度下,对根冠比的影响尤为明显。这一方面说明B6-1固态发酵产物中的γ-PGA可以促进作物的生长,另一方面由于在肥料较缺乏的时候,γ-PGA的增产效果尤为明显,也说明B6-1固态发酵产物中的γ-PGA具有肥料增效剂的作用,特别是更加有利于作物根对营养的吸收。 6.在低温下γ-PGA具有提高菌体存活率的作用,特别是随着冻藏时间的延长,保护作用越显著。γ-PGA添加浓度以1.5%为适宜。经过冷冻干燥和冻藏一定时期后,添加γ-PGA的乳酸菌产酸活力下降较少,且基本没有迟滞期,都能在更短时间内产酸。


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