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胸膜肺炎放线杆菌TbpB-ELISA的建立及zmp和arcA/arcB基因的初步研究

葛行义  
【摘要】: 胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)的病原菌,引起猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成严重的经济损失。该病原菌的毒力因子主要包括外毒素、脂多糖、荚膜多糖、外膜蛋白、蛋白酶等。转铁结合蛋白(Tbp)是APP重要的膜蛋白,为所有血清型所共有,用于铁离子的获取。zmp基因编码的金属蛋白酶可在宿主体内表达,预测是APP重要的毒力因子,与APP在宿主呼吸道上皮细胞的吸附定殖过程中起重要作用。ArcA-ArcB二元调控系统参与APP厌氧呼吸相关基因的表达调控,可能对APP的代谢和毒力有重要的影响。本研究主要包括以下三个方面内容: 1.胸膜肺炎放线杆菌tbpB基因的克隆表达与间接ELISA方法的建立 转铁结合蛋白(TbpA和TbpB)是胸膜肺炎放线杆菌重要的膜蛋白,其中TbpB位于细菌表面,在APP的致病性和免疫反应中起着重要的作用。本试验用PCR方法克隆了APP血清1型菌的tbpB基因的编码区(1,644bp),在大肠杆菌中进行了高效表达。用纯化的表达产物建立了ELISA检测方法,对其特异性、敏感性进行了测试,与间接血凝试验试剂盒进行了对比研究,并用该方法检测了临床血清980份。结果表明TbpB-ELISA方法有较好的敏感性,但特异性较差,检测的临床血清的阳性率为53.57%,所检测的阳性率尽管不能完全反映猪传染性胸膜肺炎的流行情况,但在一定程度上可以对猪传染性胸膜肺炎的流行情况提供参考。 2.胸膜肺炎放线杆菌金属蛋白酶(zmp)基因的研究 根据已知的APP血清1型的zmp基因序列,用PCR方法克隆了其全长编码序列(2,610bp),在大肠杆菌中获得了高效表达;用特异蛋白底物检测了重组蛋白的蛋白酶活性;先后尝试了三种zmp基因缺失突变体构建方法,最终成功构建了APP血清1型zmp基因部分缺失突变株,并对突变株的生长特性进行了研究,对突变株与亲本株的毒力作了比较。结果表明重组蛋白在酪蛋白等特定底物存在时表现出相应的蛋白酶活性;zmp基因部分缺失突变株与亲本株的体外生长特性未见明显差异,提示zmp基因对APP体外生长影响不大;毒力比较表明zmp基因部分缺失突变株比亲本株的毒力有15-20倍下降,提示zmp基因对APP毒力有一定影响。 3.胸膜肺炎防线杆菌ArcA-ArcB二元调控系统的研究 根据已公布的APP基因组序列,通过与大肠杆菌等细菌基因组的比较,找出了APP基因组中存在的五组二元调控系统,并选择了厌氧呼吸控制系统ArcA-ArcB系统进行了研究。主要目的是构建单基因和双基因缺失突变株,并利用基因芯片的方法研究ArcA-ArcB系统所调控的基因,进而探讨其对厌氧呼吸条件下对APP与宿主相互作用的影响。在本论文中主要完成了前期分析工作,并构建了相应的同源重组缺失突变体载体,为后续研究作了准备。


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1 葛行义;胸膜肺炎放线杆菌TbpB-ELISA的建立及zmp和arcA/arcB基因的初步研究[D];华中农业大学;2008年
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