CP5型金黄色葡萄球菌荚膜多糖的提取纯化与鉴定

【摘要】： 目的:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是奶牛乳房炎的主要致病菌,其主要致病因子之一是其细胞壁外面的一层保护膜——荚膜多糖(capsularpolysaccharide,CP)。研究发现,CP5型和CP8型金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎主要致病菌株,因此,本实验选取荚膜多糖5型金黄色葡萄球菌,通过细菌培养,提取、纯化和鉴定其荚膜多糖,为进一步了解荚膜多糖在细菌生物学上的作用和免疫学用途做准备。 方法:细菌在50个哥伦比亚血琼脂基础培养基平板上24h培养后用磷酸缓冲液生理盐水收集。菌液经121℃,1h高温高压处理后25,000×g离心沉淀,收集上清液。无水乙醇30%(V/V)4℃过夜,离心去除沉淀。上清液加入核糖核酸酶A和脱氧核糖核酸酶Ⅰ,37℃过夜,链霉蛋白酶和蛋白酶K 37℃过夜。12～14KDa截留分子量透析袋三蒸水透析。无水乙醇80%(V/V)4℃过夜,离心收集沉淀,得有粘稠感白色粗荚膜多糖。加入PBS,溶解粗提物,高碘酸钠黑暗处常温处理,用25%(V/V)乙二醇终止反应,三蒸水透析。超滤离心管去除大于100KDa和小于50KDa物质。30KDa和10KDa超滤管浓缩样品,葡聚糖纤维纯化荚膜多糖,紫外光分光光度计490nm检测,含多糖样品低压冻干保存。 结果:苯酚-硫酸法测定粗制荚膜多糖样品含糖量为:26.15μg/ml,即29.88%;核酸蛋白仪测定核酸含量为0.1113 mg/ml,蛋白质含量为0.0103 mg/ml;高效液相色谱鉴定样品多糖的单糖主要组成成分为:甘露糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸,葡萄糖、半乳糖、木糖及阿拉伯糖。 结论:经高效液相色谱对荚膜多糖样品进行单糖组成分析和600兆高灵敏度核磁共振氢谱一级结构分析,样品基本上与国外研究相符合。