源于水稻的链霉菌菌株F-1的鉴定及其防病潜力和防病机制研究

【摘要】： 由Rhizoctonia solani引起的水稻纹枯病是水稻的重要病害之一,对于该病的生物防治已成为研究热点。植物的体围存在着一些微生物自然群体,它们中的有些种类,如链霉菌等对植物病原菌具有拮抗性,因而可将其作为生防菌来开发利用。评估拮抗菌的防病潜力是其开发利用的前提,而了解其防病机理是增强其防病能力的基础。本研究从健康水稻植株分离得到一个对水稻纹枯菌、灰霉菌和核盘菌等植物病原真菌有显著拮抗作用的链霉菌菌株F-1。在此基础上对菌株F-1的分类鉴定、防病潜力和防病机制进行了系统研究,结果如下: 1.从湖北、湖南和山东等5个省的13个不同地区所采集的健康和感染水稻纹枯病的水稻植株上分离得到385个细菌菌株和2个链霉菌菌株。综合平板对峙培养和离体防病效测定的结果,筛选出对水稻纹枯菌有显著拮抗作用,对水稻纹枯菌侵染水稻叶片有显著抑制效果的链霉菌菌株F-1。 2.采用传统分类鉴定方法和现代分子分子生物学鉴定方法相结合,菌株F-1鉴定为普特拉链霉菌(Streptomyces platensis F-1)。其16S rDNA序列已在GenBank数据库中注册,注册号为EF583557。 3.在离体水稻叶片、水稻苗及盆栽水稻上测定了链霉菌F-1产生的抗菌物质(antifungal substance.AFS)对水稻纹枯病的防效,评估链霉菌F-1防病潜力。试验结果表明:用含有链霉菌F-1的培养物滤液(AFS_(PDB))处理水稻叶片或水稻植株,能有效的抑制水稻纹枯菌的侵染,使水稻纹枯病的发病严重度显著下降。例如,离体水稻叶片防效试验中,接种3d后,无菌水处理组的水稻叶片病害严重度达到2.2级,而用AFS_(PDB)处理的水稻叶片病害严重度只有0.9级。对水稻纹枯菌的离体拮抗性测定试验表明,链霉菌F-1产生的AFS处理的水稻纹枯菌菌丝生长速度减慢,菌丝出肿胀、变形,褶皱等异常形态,尤其是顶端菌丝表现最为明显。 4.研究了影响链霉菌F-1产生抗菌物质的因子及其抗真菌物质的基本属性。试验结果表明:链霉菌菌株F-1液体发酵3d后,其生物产量、抗菌物质产量即可达到高峰。适宜菌株F-1生长及抗菌物质产生的pH值范围在5～8,最适pH值为6～7。链霉菌F-1可以利用供试的8种碳源(蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、肌醇山梨醇和甘露醇)进行菌丝生长,最适碳源是葡萄糖和麦芽糖。除乳糖外,链霉菌F-1可利用其余7种碳源产生抗菌物质,最适碳源是肌醇。链霉菌F-1可利用供试的6种氮源(硫酸铵、硝酸铵、尿素、碳酸铵、硝酸纳、硝酸钾)进行菌丝生长和产生抗菌物质。硫酸铵和硝酸铵适于F-1生长,而硝酸钾适于F-1产生抗菌物质。链霉菌F-1产生的抗菌物质对热敏感:对酸性环境不敏感,但碱性环境对其活性有影响;对紫外线照射抵抗;对蛋白酶K不敏感;对氯仿敏感;可被硫酸铵盐析沉淀下来;抑菌谱测定表明,F-1产生的抗菌物质的抑制对象具有选择性。除水稻纹枯菌之外,还能有效抑制灰霉菌、核盘菌、稻瘟菌和柑橘炭疽菌等。 5.采用盐析沉淀及透析,以及Sephadex G-100柱层析法,从链霉菌F-1液体培养物中,分离到一种具抗菌作用的蛋白质,分子量约为33kDa。F-1菌落表面(或菌丝及孢子表面)、菌丝内和液体培养物滤液中均含有抗菌物质。 6.发现链霉菌F-1产生的挥发性气体对水稻纹枯菌、核盘菌和灰霉菌的侵染具有显著的抑制效果。采用顶空固相微萃取技术和气质联用(GC/MS)分析法,鉴定出16种挥发性物质。这些物质可分为醇类、酯类、有机酸类、烷烃类、酮类和烯烃类。其中包括土腥味物质Geosmins和两种已知的抗真菌,苯乙醇和(+)-表双环倍半水芹烯。