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黑米花色苷对CCl_4诱导小鼠肝损伤的保护作用及其抗氧化机制

侯方丽  
【摘要】: 近20年来,评价和筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。黑米作为重要的优异稻种资源,因其糙米(颖果)果皮和种皮内富集有天然花色苷化合物,是开发天然抗氧化剂的重要来源。自由基是造成肝脏损伤的一个主要因素。目前,肝损伤的防治仍是一个全球性的严峻课题,筛选保肝药物或食物具有十分重要的现实意义。本实验室发现黑米花色苷有较强的清除自由基作用,因此本文在探讨了黑米花色苷(Black rice anthocyanins,BRA)分离纯化工艺的基础上,采用HPLC法鉴定了其主成分,通过建立亚急性小鼠肝损伤模型,探讨了BRA对四氯化碳(CCl_4)诱导小鼠的肝损伤的保护和氧化应激的影响,结合其体外清除自由基抗氧化活性和对CCl_4诱导的L-02肝细胞损伤的保护,从抗氧化的角度探讨了BRA对肝损伤保护作用的主要机制。主要研究结果如下: 1 BRA的分离纯化及其成分鉴定研究:研究大孔树脂对BRA的吸附纯化,并采用HPLC分析纯化前后BRA花色苷种类和含量。结果表明:AB-8大孔树脂对BRA有较好的分离纯化效果,其最佳工艺参数为,上柱液pH=2,样品浓度1.0mg/ml,吸附流速1.0ml/min,以70%乙醇为解吸剂,洗脱速度1.0ml/min。在该条件下,树脂的重复利用率好,使用5次后吸附率无显著性差异(P>0.05),使用7次后,吸附率仅降低2.58%。BRA经AB-8大孔树脂纯化后,总抗氧化能力提高3.99倍。通过比照标准品,分析BRA中矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cyanidin-3-glucoside,C3G)为36.98%、芍药定-3-葡萄糖苷(Peondidin-3-glucoside,Pn3G)为4.88%、天竺葵色素-3-葡萄糖苷为(Pelargonindin-3-glucoside,Pg3G)2.76%,分别占总花色苷总含量为82.88%、10.94%和6.18%。 2 BRA对CCl_4亚急性小鼠肝损伤的的保护和氧化应激的影响:研究了BRA对CCl_4小鼠亚急性肝损伤的保护及抗氧化作用,分析小鼠血清肝酶活性和氧化-抗氧化水平,并通过HE染色观察肝组织病理学变化。结果表明:小鼠摄入BRA后的低(0.40g/kg bw)、中(0.80g/kg bw)、高(1.60g/kg bw)剂量组经CCl_4诱导的亚急性肝损伤小鼠的ALT、AST活性较模型组显著降低(P<0.05),血清和肝脏中MDA的生成量显著减少(P<0.05),SOD、GSH-Px活性明显增强(P<0.05),肝脏组织的总抗氧化能力(T-AOC)显著提高(P<0.05);摄入高剂量BRA,8-OHdG的含量显著降低(P<0.05);由CCl_4引起的肝脏组织气球样变、脂肪变性,炎症浸润等病理学损伤,喂食BRA后,均可得到明显改善。 3 BRA的体外清除自由基抗氧化活性研究:比较了不同化学体系中经大孔树脂AB-8纯化前黑米花色苷粗提物CBRA(Crude extract of black rice anthocyanins,CBRA)和纯化后BRA的抗氧化活性,并分析了BRA中3种主要花色苷单体C3G、Pn3G、Pg3G的抗氧化能力大小。结果表明:BRA具有一定的还原能力和抗氧化活性,对DPPH·有较好的清除作用,BRA比CBRA显示出更强的上述活性。当浓度为0.025g/L时,BRA总抗氧化值为1.993mmol/g,是CBRA的3.99倍。CBRA清除DPPH·的IC_(50)值为22μg/ml,BRA清除DPPH·的IC_(50)值为12μg/ml。3种花色苷单体总抗氧能力表现为C3G>Pg3G>Pn3G,当浓度为0.1g/L时,C3G的TAC值为1.299,Pg3G的TAC值为0.173,Pn3G的TAC值为0.112,三者差异极显著(P<0.01)。3种花色苷单体清除DPPH·能力表现为C3G>Pg3G>Pn3G,三者清除DPPH·能力IC_(50)分别为2.50μg/ml、14.00μg/ml和25.40μg/ml,差异达极显著水平(P<0.01)。 4 BRA对人胚胎肝细胞株L-02 CCl_4损伤的保护作用研究:通过建立CCl_4对人胚胎肝细胞株L-02的损伤模型,研究了不同剂量BRA及其3个单体C3G、Pg3G、Pn3G对CCl_4损伤的L-02肝细胞损伤的保护作用,结果表明:CCl_4诱导小鼠肝细胞损伤的最适损伤浓度为20mmol/L,损伤时间为6 h。经CCl_4损伤后模型组细胞存活率仅为45.68%,上清液肝酶活性显著升高(P<0.05),抗氧化活性呈降低趋势,脂质过氧化产物MDA和NO含量显著增加(P<0.05)。BRA可一定程度地改善肝细胞L-02损伤,能明显提高肝细胞的存活率,且浓度越高,效果越好,存在明显剂量效应关系(P<0.05),能减少CCl_4所致肝酶ALT、AST的释放,并表现剂量效应。BRA中的3种花色苷单体C3G、Pg3G、Pn3G,对CCl_4损伤亦表现出不同程度的保护性抑制作用,主要表现在一是提高细胞存活率,且浓度越高,效果越好,其中C3G使细胞存活率最高达88.56%,比模型组提高94.89%。相同浓度的花色苷,C3G对CCl_4所致肝细胞损伤的保护作用最强,且作用效果C3G>Pg3G>Pn3G。二是不同程度地拮抗CCl_4造成的L-02细胞转氨酶ALT、AST的释放。80μg/ml花色苷作用时,3种花色苷单体均能显著性降低AST、ALT活性,且3者差异显著(P<0.05),C3G组细胞AST、ALT活性下降至66.56U/L、53.18U/L,分别是Pg3G组AST、ALT活性的84.22%、66.95%,是Pn3G组AST、ALT活性的91.23%、65.00%。在同浓度下,花色苷对CCl_4诱导肝细胞损伤肝酶活性的抑制作用的总体趋势是C3G>Pg3G>Pn3G。 5 BRA对CCl_4损伤人胚胎肝细胞株L-02氧化应激的影响及其护肝机制研究:研究了不同剂量BRA及其3个单体C3G、Pg3G、Pn3G对CCl_4损伤的L-02肝细胞氧化应激的影响,结果表明:加入BRA预先孵育,能降低细胞NO含量,提高肝细胞抗氧化水平。80μg/mlBRA作用时,能显著降低CCl_4引起的NO含量的增加;20μg/mlBRA作用,能显著降低细胞MDA含量;BRA还能显著升高GSH含量,当剂量达到120μg/ml时,细胞GSH水平升高,接近未经CCl_4处理的正常对照组(P>0.05)。同时,BRA能显著改善SOD和CAT酶活的降低(P<0.05),作用剂量越高,改善作用越明显。BRA中的3种花色苷单体C3G、Pg3G、Pn3G,对CCl_4损伤的肝细胞抗氧化体系亦表现出不同程度的保护性增强作用,主要表现在一是能降低NO含量。当C3G浓度达80μg/ml时,NO含量明显降低(P<0.01),Pg3G和Pn3G对NO的生成量影响不明显。3种花色苷单体中,只有C3G表现出对NO生成的抑制作用。二是不同程度地拮抗CCl_4造成的L-02细胞MDA含量的增加。当花色苷作用剂量为40μg/ml时,C3G和Pg3G组显著降低MDA含量,差异显著,较模型组MDA含量分别降低了23.73%、3.96%,而Pn3G组不明显。花色苷对CCl_4诱导肝细胞损伤脂质过氧化产物MDA的抑制作用的总体趋势是C3G>Pg3G>Pn3G。三是能提高GSH含量。当40μg/ml花色苷作用时,C3G能显著性增加GSH含量,Pg3G和Pn3G无显著差异(P>0.05)。80μg/ml花色苷作用时,C3G和Pg3G能显著性增加GSH含量,Pn3G对GSH含量无明显作用。花色苷对CCl_4诱导肝细胞损伤GSH含量的增加作用的总体趋势是C3G>Pg3G>Pn3G。四是能增强SOD和CAT的活性。80μg/ml花色苷作用肝细胞时,3种单体均能显著增强SOD、CAT活性,C3G组SOD活性值是Pg3G组的1.54倍,是Pn3G组的1.93倍;C3G组CAT活性值是Pg3G组的1.28倍,是Pn3G组的1.42倍最强。花色苷对抗氧化酶活性的增强效应中,C3G>Pg3G>Pn3G。 本文的创新点 率先发现并确证了BRA能显著降低CCl_4肝损伤小鼠的肝酶活性,减轻对肝组织病理学损伤,表现明显的护肝作用,其机制与其提高抗氧化系统的活性、降低脂质过氧化产物MDA的抗氧化作用密切相关。明确BRA的主要花色苷单体为C3G、Pg3G和Pn3G,发现3种单体在体外不同化学体系具有抗氧化活性,且对CCl_4诱导损伤的肝细胞L-02具有一定的保护作用,能提高细胞存活率,降低肝酶活性,提高细胞氧化-抗氧化系统的抗氧化活性。其中,C3G是提高细胞存活率和提高细胞抗氧化水平的主要物质基础,从而从细胞水平上明确了黑米花色苷护肝的主要机制。 本研究属现代生命科学研究的前沿问题,对丰富自由基生物学和稻种资源学理论具有重要价值;研究结果对挖掘和利用优异稻种资源,扩大黑米作物的种植面积,调整和优化农业结构,提高农业效率,带动特色稻米等农产品的深加工和综合利用,对改善人民的主食结构,促进我国特色农产品走向国际市场具有重要意义。


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