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新型DNA碱基甲基化修复酶AlkC的表达、纯化、结晶与功能探讨

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【摘要】: DNA碱基损伤广泛存在于原核生物和真核生物中。为了维护基因的完整性,生物体中DNA糖基化酶能够特异性地识别损伤碱基,将其翻出DNA双螺旋,催化水解损伤位点碱基和脱氧核糖之间的糖苷键,最终在核酸内切酶Ⅲ、聚合酶和连接酶的作用下而将DNA修复。昆虫的细胞中也广泛存在着DNA碱基损伤,其得不到修复或修复失败,将对昆虫的生存构成严重威胁,对DNA碱基切除修复机制的研究有利于新农药的开发。DNA糖基化酶如何在数量巨大的正常碱基中找到少有的损伤碱基,目前还存在着很大的争论。AlkC是2006年在微生物中发现的一种新的3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶,它特异性识别和移除损伤碱基的机制目前还没有报导。为了研究AlkC与其它的DNA碱基甲基化损伤修复酶在识别和修复机制上有何异同,本文利用基因工程手段,通过各种层析技术,利用荧光光谱的方法对AlkC的表达、纯化与功能进行了研究,并尝试了对其结晶,以期对AlkC的结构与功能进行相关探讨。主要结果如下: 1 AlkC、AlkA和AAG表达质粒的构建 利用分子克隆技术,成功构建了含6×His·tag的pET-28a AlkC、pSJ2 AlkC、pSJ2 AlkC-27、pET-28a AlkA和pET-28a AAG重组质粒。 2 AlkC、AlkA和AAG的表达和纯化 将构建成功的表达质粒转化到宿主菌BL21(DE3)中,从诱导温度、诱导剂IPTG的浓度和诱导时间等方面对目的蛋白的表达条件进行了优化。结果表明,AlkC、AlkA和AAG在低温下都能实现可溶性表达,并且表达量很高;而pSJ2AlkC-27以包涵体表达。对目的蛋白经过镍柱亲和和凝胶过滤色谱两步纯化获得了高纯度的AlkC、AlkA和AAG蛋白。 3 AlkC的功能研究 利用荧光光谱法对不同pH条件下的AlkC、AlkA和AAG蛋白进行了活性测试。实验表明,AlkC和AlkA的活性对pH的依赖性不强,AAG的活性受pH值的影响较大;AlkC可能与AlkA具有相似的识别3-甲基腺嘌呤的机制。 4 AlkC的结晶条件筛选 对AlkC的结晶条件进行了广泛的筛选,结果发现自由态的AlkC较难结晶。当向AlkC中加入小分子底物3-甲基腺嘌呤后,与自由态的AlkC相比,复合态的AlkC蛋白更容易结晶。


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