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重组杆状病毒作为一种新型的基因治疗载体的研究

潘永飞  
【摘要】: 长期以来,由于其宿主特异性,杆状病毒载体仅限于在昆虫细胞内表达外源蛋白。但最近的研究发现,携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能有效转导哺乳动物细胞并且可以在哺乳动物细胞中高效表达外源蛋白。由于其转导效率高、易操作、增殖滴度高、易扩增、载体容载量大、在哺乳动物细胞中不复制和生物安全性好等优点,重组杆状病毒有望成为良好的基因治疗载体。 Apoptin是一种来源于鸡贫血病毒的小蛋白,能特异性诱导大量的肿瘤细胞和转化细胞产生凋亡,而对正常二倍体细胞无凋亡诱导作用。特异的肿瘤细胞杀伤性使Apoptin成为癌症基因治疗的一种新的工具。 Duchenne型肌营养不良症(Duchenne musculardystrophy,DMD)是一种以骨骼肌进行性变性、坏死为主要病理特征的致死性X-性连锁隐性遗传性肌病,目前尚无有效的治疗方法,基因治疗被认为是治疗该病最有希望的途径。但是现有的基因治疗载体的载体容载量少、需要复制辅助病毒和存在着生物安全性等局限性大大的限制它的临床应用。因此提高治疗基因在体内的表达效率以及选择合适的载体将是治疗DMD获得成功的关键。 鉴于上述的研究背景,本研究探讨了含有Apoptin蛋白的重组杆状病毒在体外、体内的抑瘤的作用;研究了含有microdystrophin蛋白的重组杆状病毒在体内和体外的microdystrophin表达情况,比较了重组杆状病毒和重组腺病毒在体内基因治疗mdx鼠的效果。主要研究内容如下: 1.重组杆状病毒BV-Apoptin的构建 从质粒pVAX-Apoptin中PCR扩增全长的Apoptin片段,经酶切克隆到真核表达载体pcDNA3.1-HisB中,构建重组质粒pcDNA3.1-His-Apoptin。然后将CMV启动子驱动的编码Apoptin蛋白的整个读码框插入转移载体pFast-VSV-G中VSV-G的下游,构建转移载体pFast-G-Apoptin。将此重组质粒转化DH_(10)Bac大肠杆菌,通过蓝白斑菌落及抗性筛选,获得重组穿梭载体Bacmid-Apoptin,提取其基因组并转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-Apoptin。 2.重组杆状病毒BV-Apoptin的体外转导研究 重组杆状病毒BV-Apoptin在细胞中有正确的定位。在人肝癌细胞HepG2中Apoptin主要定位于细胞核,在人胚肾细胞HEK-293中,Apoptin定位于细胞质中。体外转导试验表明,构建的重组杆状病毒BV-Apoptin能高效转导HepG2细胞,Apoptin的表达水平与杆状病毒的感染剂量成正相关,当感染复数越高,表达Apoptin蛋白的细胞数越多。 3.重组杆状病毒BV-Apoptin在体外、体内的抑瘤作用 将重组杆状病毒BV-Apoptin分别以不同感染复数转导HepG2细胞,通过DNA-Ladder和TUNEL检测细胞凋亡。结果显示,重组杆状病毒BV-Apoptin能够诱导转导的人肝癌细胞HepG2的产生凋亡,并且BV-Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的能力呈剂量依赖性。实验利用异体同源肿瘤细胞系移植的方法复制了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,研究构建的重组杆状病毒BV-Apoptin的体内抑瘤效果。结果显示,注射BV-Apoptin能够明显抑制小鼠肿瘤的生长,同时也提高荷瘤小鼠的存活率。以上结果提示,重组杆状病毒BV-Apoptin有望成为治疗肿瘤的一种新的有效手段。 4.重组杆状病毒BV-MICDYS的构建 从载体pcDNA3.1(+)中酶切CMV启动子的表达框,插入转移载体pFast-VSV-G中VSV-G的下游,构建转移载体pFast-G-CMV;然后从质粒pBSK-MICRO酶切全长的microdystrophin基因,分别克隆到pFast-G-CMV中,构建质粒pFast-G-MICDYS。转化DH_(10)Bac大肠杆菌,通过蓝白斑菌落及抗性筛选,获得重组穿梭载体Bacmid-MICDYS,提取其基因组并转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-MICDYS。 5.重组杆状病毒BV-MICDYS转导C2C12细胞 将构建的重组杆状病毒BV-MICDYS以不同的感染复数(50、100、200MOI)转导C2C12细胞,转导后48h检测microdystrophin基因的表达。结果显示,重组杆状病毒BV-MICDYS能高效转导C2C12细胞,呈现明显的剂量依赖性。结果还显示,相同感染复数的Ad-MICDYS感染的C2C12细胞中microdystrophin蛋白表达数量低于相同感染复数BV-MICDYS转导的C2C12细胞中microdystrophin蛋白表达数量,说明了在C2C12细胞中,杆状病毒有着比腺病毒更高的靶基因表达水平的能力。 6.体内研究重组杆状病毒BV-MICDYS在mdx TA中的转导 将重组杆状病毒BV-MICDYS分别以不同的剂量(10~(10)pfu/mL,10~9pfu/mL,10~8pfu/mL)注射到mdx TA,2周和8周后做肌肉组织冰冻切片,HE检测肌肉病理的改善情况,免疫组化检测microdystrophin蛋白的表达,同时做原位检测等长拉伸诱导损伤后TA肌肉收缩力恢复情况。试验结果表明,在注射后2周,重组杆状病毒BV-MICDYS能介导microdystrophin蛋白在小鼠体内的肌肉细胞中高效表达,并且表达水平其呈现剂量依赖性,能更好的改善肌肉病理状况。但重组杆状病毒在注射后8周,未检测到其治疗效果,显示重组杆状病毒BV-MICDYS较适用于DMD的短期治疗。


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