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莱克多巴胺及磺胺二甲基嘧啶免疫学快速检测技术研究

李学伍  
【摘要】: 莱克多巴胺属于β-受体激动剂家族苯乙胺类成员之一,此类化合物因其具有促进和提高动物生长效率而受关注,莱克多巴胺在增加猪日增重、提高胴体瘦肉率、增加饲料转化、降低脂肪的积聚、缩短饲养周期等方面具有强大的功效。莱克多巴胺常被猪场作为饲料添加剂使用,莱克多巴胺的非法使用,导致了其在动物体内的蓄积性残留,引发人体的急性食物中毒。因此,我国及欧盟各国政府禁止进口含有Rac的肉品,并明确规定禁止使用Rac作为促生长剂。为了控制和预防猪的某些疾病、促进猪的生长,磺胺二甲基嘧啶常常被添加在猪的饲料之中,磺胺二甲基嘧啶在饲喂动物的组织中具有蓄积作用,猪组织中磺胺二甲基嘧啶的残留,对消费者而言将是一种潜在的危害,可引起过敏反应、干扰肠道菌群并诱生抗性菌群,从而导致抗生素的疗效下降。磺胺二甲基嘧啶还是一种可疑的致癌物,研究表明高浓度的磺胺二甲基嘧啶可以引起鼠的甲状腺瘤。FDA规定了磺胺二甲基嘧啶的休药期为15d,并设定了磺胺二甲基嘧啶在组织中的最高残留限量为100ng/g。近年来,磺胺二甲基嘧啶及莱克多巴胺残留已成为人们共同关注的重大问题。 以GC、MS、LC技术为基础建立了检测Rac、SM2的确证方法,这些方法具有高度的敏感性,但所需仪器设备昂贵、前处理繁琐、检测费时,要完成大量样品的检测存在较大的困难,因此,目前急需简单快速、经济实惠、能够用于大批样品的检测方法。本研究旨在研发敏感特异、简单快速、能用于日常监督和检测的可靠筛选方法。在该研究中重点集中于BSA-SM2、BSA-Rac的免疫原性的研究,建立了能够高效分泌SM2、Rac单抗的杂交瘤细胞9株,并制备生产了上述单抗。设计研发了SM2、Rac残留检测试剂盒4种、快速检测试纸条2种,产品性能通过了HPLC、GC-MS的确证。主要研究内容如下: 在分析Rac分子结构和免疫原性的基础上,利用化学修饰法将活性基团羧基引入Rac苯环上,应用混合酸酐法使引入的活性基团羧基与牛血清白蛋白(BSA)分子上的氨基发生反应形成酰胺键,制备BSA-Rac结合抗原,用同样的方法制备OVA-Rac。用重氮化法将SM2偶联于BSA和鸡卵清蛋白OVA,合成人工免疫原BSA-SM2和包被抗原OVA-SM2,通过红外(IR)、紫外(UV)、SDS-PAGE分析,证明药物与蛋白成功偶联,BSA-SM2、BSA-Rac分子结合比分别约为1:19和1:20;小鼠免疫实验证明,上述人工抗原能够诱导针对药物的特异性抗体。 用BSA-SM2、BSA-Rac免疫Balb/c鼠5次,SM2、Rac抗体效价均达到了6.4×10~3,SM2半数抑制浓度(IC50)为9.51 ng/mL,Rac的IC50为7.11 ng/mL,经琼脂扩散、阻断ELISA、胶体金印迹实验鉴定,除磺胺甲基嘧啶与SM2抗体轻微交叉外,其它化合物与SM2抗体和Rac抗体均无交叉反应。 以聚乙二醇(PEG1500)为融合剂,将免疫鼠脾细胞与NS0瘤细胞融合建立了杂交瘤细胞系,获得了稳定分泌抗SM2和Rac高亲和力、高敏感性抗体的杂交瘤细胞9株。SM2杂交瘤细胞株分别为SM2H10,SM2E2,SM2A10和SM2G5,细胞上清效价为3.2×10~2-6.4×10~2,腹水效价为6.4×10~4-3.2×10~5,单抗亚型为IgG2a/κ,IgG1/λ,IgG1/κ,亲和常数(Ka)为3.71×10~8-2.21×10~9L/mol。Rac杂交瘤细胞株分别为RacB5,RacC3,RacE6,RacH1和RacF4,细胞上清效价为3.2×10~2-6.4×10~2,腹水效价为1.28×10~5-6.4×10~5,单抗亚型为IgG2a/κ,IgG2b/λ,IgG1/κ,IgG2a/λ,亲和常数(Ka)为5.46×10~8-3.43×10~9L/mol。 研制出了SM2、Rac快速检测试剂盒A(SM2-Kit A,Rac-Kit A)和试剂盒B(SM2-Kit B,Rac-Kit B),试剂盒A的标准曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合,线性检测范围为1.0-128.0 ng/mL,检测限为1.0 ng/mL。SM2-KitA和Rac-Kit A饲料的平均添加回收率分别为89.4%、89.1%、猪尿的平均添加回收率分别为90.5%、91.8%;平均批内和批间变异系数均小于15%;SM2-KitA与磺胺甲基嘧啶的交叉反应率为2.75%,Rac-Kit A与其他化合物无交叉反。不同稀释基质对SM2-KitA和Rac-Kit A的检测结果没有影响;试剂盒在4℃保存,有效期为6个月。试剂盒B稍逊于试剂盒A,实验结果证明两者均可用于SM2、Rac残留的快速检测。利用胶体金标记技术,成功研制了SM2、Rac残留快速检测试纸,两种试纸的标准检测曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合。Rac-Strip、SM2-Strip机读检测限分别为0.154 ng/mL和0.165 ng/mL,目测检测限分别为2.0 ng/mL和3.0 ng/mL,SM2-Strip与磺胺甲基嘧啶有轻微交叉反应,Rac-Strip无交叉反应,检测试纸在4℃保存,有效期为12个月。 HPLC确证实验表明,SM2-strip和HPLC之间的差异为1.3%-4.3%,SM2-kit和HPLC之间的差异为2.5%-4.6%;数据统计分析证明SM2-strip及SM2-kit和HPLC检测结果无显著差异。GC-MS确证实验表明,Rac-strip和GC-MS的差异为1.0%-4.7%,Rac-kit和GC-MS的差异为1.1%-4.0%,数据统计分析证明Rac-strip、Rac-kit和GC-MS检测结果无显著差异。SM2和Rac试剂盒和试纸条,具有特异敏感、简单快速、易于操作、经济实惠的特点,试剂盒检测需时40min,试纸条检测需时10min,结果可靠,可用于定性和半定量检测。


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