胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxIV的致病性及基因缺失弱毒疫苗的研究

【摘要】： 猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。 胸膜肺炎放线杆菌是一种多毒力因子病原菌,RTX(Repeat-in-toxin)毒素是其重要毒力因子。目前研究证实APP中存在4种RTX毒素,分别为ApxⅠ, ApxⅡ, ApxⅢ和ApxⅣ。毒素ApxⅠ, ApxⅡ, ApxⅢ已被证实在APP致病过程中起重要作用,目前对ApxⅣ在APP致病过程中的作用并不清楚。为阐明ApxⅣ与APP致病性的关系以及开发更为安全高效的基因工程弱毒疫苗,本研究以本实验室之前构建的APP血清7型毒素apxⅡC单基因缺失突变株HB04C~-为亲本菌株,通过同源重组和负向筛选的方法,成功缺失了apxⅣA基因,构建了APP apxⅡC和apxⅣA双基因缺失突变株QDS01。同时,以APP-Escherichia.coli穿梭载体pJFF224-XN为基础,构建了apxⅣA基因缺失突变株的互补菌株QA01。并对APP双基因缺失突变株QDS01、单基因缺失突变株HB04C~-、互补菌株QA01的生物学特性和/或免疫原性进行了研究,主要研究内容包括: 1.同源臂的扩增与自杀性重组转移质粒的构建 根据Genbank中公布的血清1型APP 4074株apxⅣ基因的序列(AF021919),从HB04C~-中克隆到apxⅣA基因N端2745 bp的片段,将其连接到pBluescript SK载体上,通过BamHⅠ/SmaⅠ双酶切后,用Klenow片段补平BamHⅠ粘性末端,与SmaⅠ平端连接,得到含有缺失了605 bp的apxⅣ基因ΔapxⅣAN,用SalⅠ/NotⅠ将ΔapxⅣAN从pBluescript SK载体上切下来连接到经同样酶切的自杀性质粒pEMOC2上,得到缺失apxⅣA基因的重组自杀性质粒pEΔⅣA。 2.双基因缺失突变株和互补菌株的构建 以含有重组转移质粒pEΔⅣA的大肠杆菌β2155为供体菌,以HB04C~-为受体菌,通过接合转移和氯霉素(Cm)抗性筛选,获得带有Cm抗性的单交换菌株,鉴定正确后,将其接种到不含Cm抗性的TSB培养基培养,再涂到含有蔗糖抗性的培养基,筛选出蔗糖抗性(Sur~R)和氯霉素敏感(Cm~S)的菌株,通过PCR、序列分析和Southernblot验证突变株正确,将双基因缺失突变株命名为QDS01。通过PCR从APP分离株HB04基因组中克隆得到全长apxⅣ基因,将其连接到APP-E.coli穿梭质粒pJFF224-XN中,得到互补质粒pVC3,将其电转化到双基因缺失突变株QDS01,通过氯霉素抗性筛选得到互补菌株,命名为QA01,并检验了穿梭质粒在APP中的遗传稳定性和ApxⅣ的表达活性。 3.突变株生物学特性的研究 将APP apxⅡC和apxⅣA双基因缺失菌株QDS01在体外连续传代培养,通过PCR鉴定,证明该缺失菌株能够稳定遗传。将QDS01和apxⅡC单基因缺失亲本菌株HB04C~-进行活菌计数,绘制生长曲线,结果表明,QDS01的增殖能力没有发生明显变化,说明apxⅣA基因的缺失对APP的体外增殖能力无影响。检测了突变株对Balb/C小鼠的致病力,结果表明QDS01较亲本菌HB04C~-毒力下降了约3倍。 4.突变株对仔猪的致病性 将APP血清7型分离株HB04、apxⅡC单缺失株HB04C~-、apxⅡC/apxⅣA双缺失株QDS01以及互补菌株QA01通过气管接种6周龄仔猪,通过感染后临床症状、肺部损伤指数、血液生化指标以及病理切片来评价不同APP菌株致病力的差异。结果表明,双基因缺失株QDS01对仔猪致病力明显低于HB04C~-,且携带apxⅣ基因的穿梭质粒pVC3可恢复其致病力。证明毒素ApxⅣ在APP致病过程中起重要作用。 5.ApxⅣAM的克隆表达及鉴别ELISA诊断方法的初步建立 克隆QDS01中缺失的基因片段apxⅣAM,并连接到原核表达质粒pGEX-KG,构建表达质粒pGEX-apxⅣAM,将其转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导,得到融合蛋白GST-ApxⅣAM,通过亲和层析获得纯化的GST-ApxⅣAM。用Western blot鉴定其免疫原性。以纯化后的蛋白作为诊断抗原包被酶标板,通过方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释倍数。通过对APP阴性血清检测界定该ELISA的阴阳性界限。初步建立了基于融合表达蛋白的ApxⅣAM-ELISA检测方法。 6.突变株对小鼠的免疫效力试验 取48只Balb/C小鼠,随机分为6组,其中第1和4组以1.0×10~7 CFU的QDS01通过腹腔注射免疫,第2和5组以相同方式接种HB04C~-,剩余两组接种TSB作为空白对照。间隔14天加强免疫,第28天以10×LD_(50)的APP血清7型菌株WF83 (1×10~7CFU)和10×LD_(50)的APP血清1型菌株4074(1.8×10~6 CFU)攻毒,连续观察5天,记录小鼠发病和死亡情况。于0天、14天和28天由尾静脉采血,检测小鼠对ApxⅡA,ApxⅣA和ApxⅣAM的抗体水平。结果表明,QDS01可以刺激小鼠产生对ApxⅡA,ApxⅣA的抗体,但不产生对ApxⅣAM的抗体,而亲本菌HB04C~-二免后ApxⅣAM抗体为阳性,说明ApxⅣAM-ELISA检测方法可用于野毒菌株和apxⅣA基因缺失突变株的鉴别诊断。免疫小鼠对血清7型APP的攻击均可提供100%保护,对血清1型APP攻击保护率为75%。 7.突变株对仔猪的免疫效力试验 取14头APP血清学和病原学阴性仔猪,随机分为3组,第1组5头用1.3×10~9CFU的QDS01以气管接种方式免疫仔猪,第2组用HB04C~-以相同方式进行免疫,第3组4头接种TSB作为空白对照。于首免后21天进行二免,二免后两周用血清1型菌株4074攻毒。观察记录其临床症状,于7天后将存活仔猪处死,剖检观察肺部损伤状况。空白对照组出现典型胸膜肺炎症状,并有一头死亡。QDSO1免疫组获得完全保护,HB04C~-免疫组有一头发病并死亡。免疫组临床症状和肺损伤指数明显低于空白对照组。于首免、二免和攻毒前采血,检测了血清中ApXⅡA,ApxⅣA和ApxⅣAM的抗体水平,免疫仔猪可产生针对ApxⅡA和ApxⅣA的抗体,但HB04C~-免疫仔猪的缺失蛋白ApxⅣAM的抗体为阳性,进一步证明ApxⅣAM-ELISA检测方法可用于QDS01免疫动物与野毒感染动物的鉴别诊断。