收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

基于活菌内标的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR方法的建立

龙飞  
【摘要】: 单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种重要的食源性致病菌,广泛的分布于自然界,人体感染后的死亡率高达20%-30%。在美国每年约有2500起由单核细胞增生李斯特菌引起的食品中毒事件,其中致使患者死亡的高达500人(美国CDC),导致的经济损失高达23亿美元。近年来随着我国即食食品消费量的日益增加,单核细胞增生李斯特菌也逐渐成为威胁我国人民身体健康的主要食源性致病菌之一。因此,针对食品生产和消费中存在的单核细胞增生李斯特菌,建立一套快速、准确的检测方法非常必要。 为解决传统PCR检测方法存在的不足,增加检测的准确性、可靠性和实用性,本文以单核细胞增生李斯特菌为研究对象,建立了一种广泛适用于食源性致病微生物检测的添加活菌内标的荧光定量PCR检测体系,可用于DNA提取前野生菌的准确定量和全程指示假阴性。主要研究内容和结果如下: 1、四种细菌检测方法的比较:以单核细胞增生李斯特菌CMCC 54002作为待测菌株,比较了PCR检测方法与目前具有代表性的BIOLOG、VITEK和CRYSTAL3种微生物快速检测系统,并对本实验室保存的9株单核细胞增生李斯特菌做了血清学分型。结果表明:这3种微生物快速检测系统与PCR检测方法相比,其前处理过程时间长,需分离出纯的单菌落,并且都只能鉴定到李斯特菌属。PCR方法通过设计单核细胞增生李斯特菌种特异性引物,可快速的鉴定出单核细胞增生李斯特菌,并且无需纯化检测样品。通过对本实验室保存的9株单核细胞增生李斯特菌进行血清学分析,结果表明本实验室菌株涵盖了单核细胞增生李斯特菌主要的致病血清型(1/2a、4b、1/2c、3b)。 2、扩增内标的设计:针对单核细胞增生李斯特菌主要毒力基因hly的保守序列,设计了一对特异性引物和相应的检测探针,并利用DNA序列随机改组软件,根据目标片断的序列特征,生成了1000组随机改组序列,然后通过荧光探针设计软件分析和BLAST-N比对筛选,找到了一条软件评分最高且与其它致病微生物基因组序列非同源的内标序列,该序列与目标片断具有相同长度(65 bp)和GC含量(55.4%),从而保证两者PCR扩增效率的一致性。 3、活菌内标的构建:选用温敏型的穿梭质粒pKSV7来构建同源重组载体pKSV7-UIKD,该载体上连有上下游同源序列、扩增内标序列及卡那抗性基因,与质粒上自带的氯霉素抗性基因一起作为共同筛选标记,进行单核细胞增生李斯特菌双交换突变株的筛选,经过10轮培养和筛选,重组几率约为1.3%(4/300)。筛选出的双交换菌株用PCR、RT-PCR和测序分析进行了验证,结果表明成功获得了含扩增内标序列的hly基因缺失突变株LM-IAC,并作为活菌内标用于后续研究。 4、准确测定野生菌DNA提取前菌体量的荧光定量PCR检测体系(LM-IACAQ-PCR assay)的建立:(1)评价了野生菌与活菌内标的DNA提取效率和PCR扩增效率,结果表明活菌内标与野生菌在10~9 cfu-10~5 cfu的范围内其DNA提取效率是相似的(约10%),同时两者具有相似的PCR扩增效率(野生菌1.05、活菌内标1.06)。(2)建立了根据活菌内标数量计算DNA提取前野生菌体量的线性回归方程y=-0.313x-0.0773,回归方程的相关系数R~2=0.9997,结果表明,根据该线性回归方程计算所得的DNA提取前野生菌菌体量与实际菌体含量基本一致,而由传统标准曲线法计算得到的菌体量要比实际量少一个数量级。 5、全程指示假阴性的荧光定量PCR检测体系(LM-IAC EQ-PCR assay)的建立:(1)运用BIOLOG系统、VITEK系统比较了野生菌和活菌内标的生化特性,结果表明野生菌与活菌内标对检测板上的各项生化物质利用能力基本一致。(2)通过均匀设计试验评价了不同活菌内标加入量对野生菌在增菌培养中的影响,结果表明10~2 cfu-10~4 cfu的活菌内标接种量不影响野生菌的生长,其生长代时分别为49min(野生菌)和55 min(活菌内标)。(3)将10~3 cfu数量级的野生菌与活菌内标分别接入牛奶、鸡肉和腌肉样品,用UVM选择性增菌液培养,并以不添加食品样品的UVM纯培养为阳性对照,分别取增菌0 h、3 h、6 h的样品进行荧光PCR检测,结果表明阳性对照和牛奶样品中的野生菌和活菌内标不经过增菌培养即可检出,鸡肉样品经增菌3 h后野生菌和活菌内标方可检出,而腌肉样品要经增菌6 h后才可检出野生菌和活菌内标。这说明本研究建立的检测体系能够指示鸡肉和腌肉样品检测中的假阴性现象,有助于提高检测的准确率,同时可有效减少增菌时间。 6、可用于单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和副溶血弧菌普通PCR检测的多重扩增内标(multiple internal amplification control,mIAC)检测体系的建立:针对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因、沙门氏菌invA基因和副溶血弧菌toxR基因设计特异性检测引物,根据这3对引物序列运用重叠PCR技术人工合成了1条多重扩增内标,可分别用于单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和副溶血弧菌的普通PCR检测。含多重扩增内标的PCR检测体系的DNA检测灵敏度分别为:单核细胞增生李斯特菌,73.0 fg/μl;沙门氏菌,5.04 fg/μl和副溶血弧菌,76.4 fg/μl。通过对40份鸡肉、60份牛奶和60份虾样品分别进行单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和副溶血弧菌的人工污染试验,结果显示鸡肉样品有2份出现假阴性、牛奶样品有2份出现假阴性、虾样品有3份出现假阴性,说明本研究建立的检测体系在进行大量样品检测时能够有效指示假阴性,有助于提高检测的准确率,并降低检测成本。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王振东;吉尚志;杨宇;王静;;双重荧光定量PCR检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌方法的建立[J];中国食品卫生杂志;2011年04期
2 熊玉娟;邱峰;刘本荣;;荧光定量PCR检测脂肪肝患者血浆循环DNA及其临床意义[J];临床医学工程;2011年07期
3 吴建华;;PAP1基因在胆囊癌中表达的研究[J];中国医疗前沿;2011年12期
4 段承刚;王丽;刘晓燕;何涛;;FHIT在人肝癌细胞系和正常肝细胞系中的差异表达[J];医学信息(中旬刊);2011年07期
5 石玉玲;曾兰兰;陈丽丹;李林海;孙朝晖;王露霞;;产气荚膜梭菌实时荧光定量PCR方法的应用[J];中华医院感染学杂志;2011年13期
6 赵勤英;沈翠芬;闵丽珊;;TaqMan PCR快速检测食品中空肠弯曲菌[J];中国高等医学教育;2011年06期
7 蔡金生;姚振江;;广州市海珠区白纹伊蚊体内登革病毒的检测研究[J];齐齐哈尔医学院学报;2011年12期
8 贾静;毕振旺;陈玉贞;侯配斌;张明;邵坤;毕振强;;山东省食品中单核细胞增生李斯特菌脉冲场凝胶电泳分型[J];山东大学学报(医学版);2011年08期
9 朱海峰;耿晓增;沈洲明;伏承平;尤永平;程刚;傅震;;荧光定量PCR检测脑胶质瘤中miR-125b[J];中国神经肿瘤杂志;2011年02期
10 张伟铮;黄彬;林冬玲;鄂顺梅;薛新娜;曾建明;陈茶;;结核分枝杆菌自身淬灭探针荧光定量PCR检测方法的建立[J];中国热带医学;2011年06期
11 马晓燕;张会彦;贾春凤;李慧;王羽;张先舟;张伟;;荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌[J];安徽农业科学;2011年15期
12 李峰;;肺结核的PCR法和涂片法检查的比对[J];齐齐哈尔医学院学报;2011年08期
13 王七生;王宁;;荧光定量PCR常见技术偏差及解决方法[J];医学信息(中旬刊);2011年07期
14 李云;夏正武;姜昌丽;;门诊女性生殖道单纯疱疹病毒Ⅱ型感染情况分析[J];解放军预防医学杂志;2011年03期
15 李维娜;韩梅芳;宁琴;;慢性丙型肝炎患者PBMC TBK1s表达[J];实用肝脏病杂志;2011年04期
16 刘彦昌;张宝莹;刘凡;;花卉培育土中嗜肺军团菌污染状况初步调查[J];环境与健康杂志;2011年04期
17 许黎黎;鲍琳琳;秦川;;季节性流感病毒H1N1实时荧光定量PCR检测方法的建立[J];中国比较医学杂志;2011年07期
18 梁丽;廖灿;李发涛;李东至;潘敏;杨昕;易翠兴;李焱;;QF-PCR技术在胎儿超声异常病例快速产前诊断中的应用研究[J];中国优生与遗传杂志;2011年07期
19 龙智钢;刘运芝;黄一伟;刘兴;;HBV-DNA与乙型肝炎血清学标志物的相关性研究[J];实用预防医学;2011年08期
20 刘琦;曾爱中;秦波;赵耀;胡接力;黄爱龙;;荧光定量PCR法分析乙肝病毒基因型及载量[J];重庆医科大学学报;2011年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 黄燕萍;王宇明;;荧光定量PCR与普遍PCR检测HBV DNA的对照分析[A];中华医学会第七次全国感染病学术会议论文汇编[C];2001年
2 吴志强;熊焰;;乙型肝炎病毒荧光定量检测与其血清标志物检测结果的相关性研究[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
3 杨柳;苏哲;苏明权;岳乔红;郝晓柯;;荧光定量PCR在HBV-DNA定量检测中的应用[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
4 季育华;赵维莅;李敏;彭亦冰;徐晓刚;支立民;潘宁;;荧光定量PCR方法监测骨髓移植患者HCMV活动性感染[A];中华医学会第七次全国感染病学术会议论文汇编[C];2001年
5 陈慧燕;;单增李斯特菌室间比对活动实验室结果评价[A];2009年卫生检验新技术学术研讨会会刊[C];2009年
6 黄彬;陈茶;罗进勇;尹一兵;;淋病奈瑟氏菌自身淬灭荧光定量PCR方法的临床应用[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
7 严子禾;潘世扬;陈丹;魏源华;谢而付;高丽;童明庆;;实时荧光PCR定量检测血浆结核分支杆菌DNA的可行性研究[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
8 张耀祺;石磊;;分离自生肉的单增李斯特菌的血清型及脉冲场凝胶电泳分型研究[A];“亚运食品安全与广东食品产业创新发展”学术研讨会暨2009年广东省食品学会年会论文集[C];2009年
9 张哲海;;微囊藻(Microcystis)的荧光定量PCR检测方法研究[A];中国环境科学学会2009年学术年会论文集(第四卷)[C];2009年
10 陈波;陈燕;钱;周晔;蒋天舒;谷明莉;邓安梅;仲人前;;急性感染期乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中颗粒溶素表达增高及意义[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 龙飞;基于活菌内标的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR方法的建立[D];华中农业大学;2008年
2 程峰;肝脏缺血再灌注损伤及益生注射液的干预机理研究[D];四川大学;2004年
3 杜喜玲;水稻和玉米组织特异表达基因的克隆及功能分析[D];复旦大学;2004年
4 郭波;CD147/Basigin、TAP63/△ NP63与眼睑基底细胞癌发病机制的相关研究[D];四川大学;2004年
5 张雨梅;洛克沙胂残留的生态毒理研究[D];扬州大学;2007年
6 贾卫国;Ouabain对大鼠心室肌起搏通道的电生理及表达的影响[D];四川大学;2005年
7 丁怡;雷公藤甲素抗血管生成的作用及机理研究[D];四川大学;2005年
8 周瑾;葡萄胎发病相关基因F10表达及功能的初步研究[D];第一军医大学;2005年
9 高岚;花背蟾蜍蝌蚪晶状体的再生及相关Pax-6基因全长cDNA克隆和表达分析[D];兰州大学;2007年
10 何闪英;中肋骨条藻增殖细胞核抗原基因表达量与生长关系的研究[D];中国海洋大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王雪梅;母外周血胎儿DNA浓度与先兆早产的相关性研究[D];青岛大学;2005年
2 王俊锋;hTcf-4 mRNA在结直肠癌组织中表达的临床病理学意义[D];四川大学;2005年
3 许琳;应用荧光定量RT-PCR检测胰腺癌病人外周血中多种基因的表达及临床意义[D];浙江大学;2007年
4 蔡莉;荧光定量RT-PCR检测有机阴离子转运多肽OATP-E基因表达的方法学研究[D];山东大学;2005年
5 柳荣华;巨噬细胞移动抑制因子在子宫内膜异位症中的表达及其作用研究[D];山东大学;2006年
6 高峰;应用荧光定量PCR法对白色念珠菌胞外DNA释放的动力学研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2006年
7 任月;应用实时荧光定量PCR方法检测肠球菌的研究[D];大连医科大学;2007年
8 廖勇;血浆EB病毒DNA定量测定对鼻咽癌的诊断价值[D];南华大学;2007年
9 郑重;康复新液对大鼠实验性结肠炎作用机制的研究[D];上海交通大学;2008年
10 宋传敏;猪细小病毒SYBR Green real-time PCR检测方法的建立及应用[D];河南农业大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 黄显斌 唐明山;谨防“非典”卷土重来[N];科技日报;2003年
2 立新;“窗口期”艾滋病可测出[N];中国人口报;2002年
3 本报记者 韩璐 / 通讯员 黄显斌 唐明山;发病当日便可检出冠状病毒RNA[N];科技日报;2003年
4 吕志平 陈胤瑜;登革热及传播媒介监测系统的开发与应用[N];中国国门时报;2004年
5 万同己;两法检测乙肝各有所长[N];中国医药报;2004年
6 《金周刊》记者 朱杰;罗氏为何青睐深圳匹基[N];中国经营报;2001年
7 饶邦安;“非典”防治与档案意识[N];中国档案报;2003年
8 田碧文;化验单“有情况”咋办?[N];大众卫生报;2004年
9 周雨;谁来保证我们的食品安全?[N];科技日报;2001年
10 本报记者 金鹂;德国SARS诊断试剂试水中国[N];中国高新技术产业导报;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978