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侵染蕌头的病毒种类鉴定及其部分病毒序列基因组特性分析

吴承春  
【摘要】: 藠头(Allium chinense G.Don)为百合科葱属多年生植物,其起源地为亚洲,是一种具有极高的经济价值的传统蔬菜作物。而藠头病毒病是致使藠头产量和品质大幅降低的主要因素。本文在田间病害调查的基础上,利用生物学、血清学以及病毒粒子形态和感病植物细胞病理特征观察,结合分子生物学方法,对来自武汉江夏区的藠头病毒样品进行了种类鉴定,并对所获病毒克隆基因组部分序列特性进行了分析,确定了该藠头产区侵染的病毒至少包括三个属4种病毒,主要研究结果如下: 1.明确发生在江夏区藠头存在复合感染现象。通过在湖北省武汉市江夏区藠头田间病害调查,发现田间藠头植株表现为花叶、褪绿条纹、植株扭曲、黄化等症状;通过汁液摩擦接种到6种指示植物上,确定部分藠头病毒病的繁殖寄主为昆诺藜;利用4个不同感病样品的粗提液,经负染后电镜观察,发现有3种不同的病毒粒子形态,包括杆状、线型(歪曲和直线型);直接采取感病藠头叶片制作超薄切片,经电镜观察发现感病寄主细胞质内含有大量的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员特异的风轮状(横切)或柱状(纵切)内含体。 2.首次发现侵染我国藠头的马铃薯Y病毒属OYDV病毒分离物。利用马铃薯Y病毒属内成员基因组简并引物,结合通用引物M4,获得该属基因组3′端序列大小约1.7kb的扩增片段,对该片段进行了克隆和序列测定,其全长为1625个核甘酸,包括部分NIb(636bp)、全长CP基因(771bp)和3′端UTR序列。将所获克隆基因组3′端核甘酸序列在数据库比对分析,发现所获病毒克隆基因组3′端区域与洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)相同区域的核甘酸同源性最近,最高达99%。外壳蛋白基因的核甘酸和推测氨基酸序列与已报道的OYDV分离物CP相应区域同源性分别为80%-99%和87%-99%;构建了CP基因核甘酸和编码外壳蛋白氨基酸序列进化树,结果显示,所获克隆基因组CP序列与来自大蒜上的OYDV云南分离物OYDV-YN2(GenBank登录序列号AJ409313)、两个江苏分离物OYDV-JS2(登录序列号AJ409310)、OYDV-JS1(登陆序列号AJ293278)及日本分离物OYDV-Gzm(登录序列号AB000840)相同区域同源性均很高(≥97%),聚成一簇。将该分离物暂命名为OYDV-WH,这是OYDV病毒侵染我国藠头的首次报道。 3.首次发现侵染我国藠头的香石竹潜隐病毒属7个不同克隆。利用香石竹潜隐病毒属内成员基因组简并引物,结合引物M4,获得该属基因组3′端核甘酸序列,共9个克隆,大小为1808-1812个核甘酸,序列特性分析表明,其包含病毒RNA基因组全长的第3-6共4个阅读框(ORF)。序列比对显示,这些克隆与现有报道的大蒜潜隐病毒(Garlic latent virus,GLV)基因组3′端相同区域的核苷酸序列最为接近,同源性分别在75%-82%之间,9个克隆中有7个克隆在该区域的核苷酸差异比较大,同源性在77%-93%之间。CP序列比对分析表明,所获得克隆基因组CP序列与目前报道的GLV基因组CP核苷酸和氨基酸同源性分别在75%-87%和88%-97%之间,其中克隆P2和carl-5基因组序列结构最相似,与日本藠头上的分离物GLV-Rjpn(登录序列号AB004565)氨基酸同源性最接近,达97%。本研究获得的具有较大序列差异的7个克隆之间基因组CP核苷酸和氨基酸的同源性分别76%-89%和88%-100%。外壳蛋白核甘酸序列进化树分析表明,7个克隆分别与其他GLV分离物共形成4个不同进化族,其中P4克隆CP核甘酸进化树上形成独立一族,且其核甘酸数量也有较大差异,因此,推测该克隆很可能为香石竹潜隐病毒属的一个新种。将所获的克隆基因组序列第3个ORF(编码蛋白TGB2)、第4个ORF(编码蛋白TGB3)和第6个ORF(编码核酸结合蛋白NABP)分别与已知报道的GLV基因组对应区域序列进行比对分析表明,氨基酸序列同源性分别为71%-90%、59%-85%、82%-95%。ORF3、ORF4、ORF6基因变异比ORF5基因变异要大些,其中ORF4变异最大,而ORF5变异主要发生在其编码氨基酸的N末端。根据Carlavirus属分类标准-不同病毒CP氨基酸同源性小于68%,同一病毒不同株系间为75%-90%。因此推断本研究所获得的克隆是属于GLV不同的分离物。这是我国藠头上的首次发现侵染GLV病毒。 利用所获病毒克隆基因组RNA3′端序列设计RNA基因组部分中间片段下游特异性简并引物pCarl-2dW(-)和上游简并引物pCare-2(+),RT-PCR扩增获得包含病毒GLV基因组的第2个ORF2及部分ORF1的片段。序列结构分析发现,ORF1和ORF2之间有30个核甘酸的非编码区。ORF2与ORF3有23个核苷酸重叠区域。ORF2共含有708个核苷酸,编码TGB1蛋白,将所获病毒克隆基因组ORF2区域序列片段与现有报道的相关病毒相同区域比对分析,结果显示该病毒基因组ORF2也存在较大的变异,核甘酸和氨基酸同源性分别在72%-78%和76%-83%。 4.首次发现侵染我国藠头的利用葱X病毒属2个不同病毒。利用葱X病毒属内成员基因组简并引物,结合引物M4,获得该属基因组3′端序列约1.0kb扩增片段,共8个克隆。其中克隆pGTdw-8基因组3′端序列含有939个核甘酸,其它7个克隆均为949个核甘酸(代号为pGTdw-15),包括部分CP基因(441个核甘酸)、完整NABP全长基因381个核甘酸和3′端非编码区。经数据库Blast序列分析表明,克隆pGTdw-8基因组3′端序列与现有报道的葱X病毒属我国大蒜上发现的大蒜病毒E(GarV-E,AJ292230)分离物相同区域核甘酸序列最相似,同源性达94%。另一个克隆pGTdw-15与大蒜病毒X韩国分离物(GarV-X,U89243)相同区域核甘酸序列最相似,具有91%的同源性,序列系统进化树表明,本研究所获葱X病毒属相关病毒克隆基因组3′端的核甘酸进化树与完整的NABP核甘酸进化树存在较大的进化族相关性和一致性。同时,基因组3′端UTR非翻译区序列的比对结果显示,本研究所得克隆pGTdw-8基因组3′端UTR与分离物Garv-E相同区域同源性达94%,另一类病毒克隆pGTdw-15基因组3′端UTR与分离物Garv-X相同区域同源性高达98%,根据国际病毒分类委员会发表的Allexivirus属分类标准是CP氨基酸同源性小于90%,3′端UTR核甘酸同源性小于90%。因此,认为本研究获得的2种克隆pGTdw-8和pGTdw-15分别属于葱X病毒属两种病毒Garv-E和Garv-X的分离物,这是我国藠头上的首次发现这两种葱X病毒属病毒。


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