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水稻T-DNA插入突变体库侧翼序列的分离和OsBC1L家族基因的功能研究

代晓霞  
【摘要】: 随着水稻基因组测序的完成,水稻基因组学研究已经步入功能基因组学时代。为了在基因组或系统水平上全面分析水稻基因的功能,最直接有效的方式是构建大量的突变群体,然后利用正向遗传学或反向遗传学策略进行基因功能的研究。对于T-DNA或转座子等插入型突变体的基因克隆,无论采用正向遗传学方法或采用反向遗传学方法,都必须分离插入位点的侧翼序列。通过建立侧翼序列数据库,人们可以很容易地检索到目的基因的突变体,从而进行基因克隆。 本研究以本实验室的T-DNA插入突变体库为材料,完成了12,432份T0代转基因植株的PCR阳性检测工作,利用TAIL-PCR技术分离得到T-DNA插入位点侧翼序列5,082条。COBRA-like蛋白在植物纤维素合成和细胞扩张中具有重要的作用,本研究采用正向遗传学与反向遗传学相结合的方法,研究鉴定了水稻中两个COBRA-like基因OsBC1L4和OsBC1L5的生物学功能。本研究还克隆了一个影响水稻分蘖数的基因LTWl并进行了功能分析。 本研究获得的主要研究结果如下: 1.完成12,432份水稻T-DNA插入突变体库TO代转基因植株的PCR阳性检测工作,其中10,770个家系为T-DNA插入阳性植株,T-DNA阳性率约为86.6%。 2.对T-DNA插入阳性的家系分离侧翼序列,共计得到T-DNA插入位点侧翼序列5,082条,其中的2,644条序列与水稻基因组匹配较好(E-value10-5),基因组定位率约为52.0%。 3.通过对分蘖突变表型的正向筛选,获得2个T-DNA侧翼序列和分蘖突变性状共分离的家系04Z11EM13 (OsBC1L4)和LTWl。 4.对水稻OsBC1L家族成员进行了分子特征、染色体位置、系谱关系及表达分析,并通过反向遗传学策略,搜集了5个OsBC1L基因的插入家系,发现OsBC1L5基因参与水稻花粉的发育。 5.在04Z11EM13家系中,T-DNA插入到OsBC1L4基因的第4个外显子中,造成了分蘖少、矮化的突变表型。通过共分离检测和互补实验克隆了OsBC1L4基因。经光学显微镜和扫描电镜观察,发现osbc1l4突变体具有不正常的细胞扩张、降低的次生壁厚度和增加的淀粉积累。通过测定纤维素和木质素含量,发现osbcll4突变体的纤维素含量下降了24%。采用RT-PCR和组织原位杂交技术分析了OsBC1L4基因的表达模式,发现该基因在薄壁组织和厚壁组织都有表达。通过进行OsBC1L4蛋白的亚细胞定位,发现该蛋白主要位于细胞壁和细胞膜上。通过表达相关性分析,发现OsBC1L4基因与初生壁形成相关的纤维素合成酶基因共表达。用real-time方法检测了纤维素合成相关基因和OsBC1L基因在osbc1l4突变体与野生型中的表达量,发现纤维素合成相关基因的表达在osbc1l4突变体中升高了,这可能反映了纤维素合成过程中的一种反馈机制,即通过升高其它纤维素合成相关基因的表达来弥补osbc1l4突变体中的纤维素损失。 6.在OsBC1L5家系中,T-DNA插入到OsBC1L5基因的唯一的外显子中。该Tos17插入家系无纯合单株。通过杂合植株与野生型植株的正反杂交,发现osbc1l5基因型的雄配子缺陷。经体外花粉萌发实验,发现OsBC1L5基因可能参与水稻花粉的萌发。通过RNAi抑制实验,发现OsBC1L5基因对水稻花粉壁的发育可能也有影响。 7.在LTWl家系中,T-DNA插入到LTWl基因的唯一的外显子中,造成了分蘖少、易枯萎的突变表型。通过共分离检测和互补实验克隆了LTWl基因。另外,在韩国POSTECH突变体库找到了一个LTWl基因的等位突变体,发现它具有与LTWl家系相同的突变表型,并且这种突变表型与在LTWl基因内的T-DNA插入也是共分离的。通过对韩国等位突变体(promoter trap line)的GUS染色,研究了LTW1基因的表达模式。


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