柑橘CBF类似基因低温胁迫下的表达与分析

【摘要】： CBF转录因子在植物低温响应网络中具有重要作用,CBF基因的诱导表达可以改善许多植物的低温和干旱耐受性。为了揭示柑橘CBF抗寒分子调控机制,本研究以枳壳,脐橙,柚和粗柠檬为主要实验材料,研究了枳CBF及相关基因在根茎叶等组织器官中低温和外源ABA条件下表达情况,橙CBF及相关基因在低温、高盐和外源ABA等胁迫条件下的表达情况。为了进一步获得柑橘CBF基因组DNA及编码蛋白质等信息,分别从四种柑橘中分离了PtCBF, CsCBF, CgCBF和CjCBF基因组DNA序列及其启动子序列,即pPtCBF, pCsCBF, pCgCBF和pCjCBF,并进行了一系列生物信息学比较分析及CBF启动子功能鉴定。通过转基因技术将柑橘CBF启动子导入烟草中,通过条件处理,检测GFP报告基因的表达活性。主要结果如下： 1.柑橘CBF及相关基因在胁迫条件下的表达分析结果表明,柑橘CBF能够响应低温、高盐及ABA胁迫,受上述胁迫调控表达。然而,枳PtCBF与脐橙CsCBF在功能上可能存在一定差异。枳PtCBF受低温上调表达,而脐橙CsCBF受低温胁迫显著下调,两者均受外源ABA上调表达。此外,枳PtCBF可能是枳MYB15的下游靶基因,枳PtCBF或MYBl5与枳冷调节基因CORc410之间可能没有直接关系；脐橙CsCBF在高盐胁迫下受脐橙MYB15转录调节,ABA条件下则调控脐橙CORc410基因的表达,脐橙MYB15与脐橙冷调节基因CORc410之间也可能存在联系。 2.柑橘CBF基因组DNA的分离和生物信息学分析柑橘CBF基因组DNA内部不含内含子；AP2 DNA结合结构域和CBF特征序列在柑橘CBF氨基酸序列中高度保守；CBF蛋白质高级结构分析表明,其AP2 DNA结合结构域内部含有3个反向平行的p-折叠和1个α-螺旋结构,他们可能直接参与基因的转录调控；同时推测,柑橘CBF作为转录因子极可能定位于细胞核内,调控下游基因的转录表达。枳PtCBF,橙CsCBF,柚CgCBF及粗柠檬CjCBF在核苷酸水平和氨基酸水平上,枳PtCBF与其他三种柑橘CBF之间没有显著差异。 3.柑橘CBF基因启动子序列的分离及元件分析序列比对分析发现,柑橘CBF启动子序列一致性高达90%以上。柑橘CBF基因转录起始位点可能位于翻译起始密码子上游185 bp处。PLACE和PlantCARE分析发现,四种柑橘CBF启动子序列中含有多种常见胁迫相关顺式作用元件,如ABRE, MYBR, MYCR, G-Box, W-Box以及生物钟响应元件等。然而,只在枳pPtCBF中检测到LTRE元件,其他三种柑橘CBF启动子中没有检测到该识别序列,但预测了一个CBFHV类似元件。此外,粗柠檬CBF启动子分离过程中获得长短两条序列。对柑橘CBF启动子各序列进行剪接,可以将其划分为2个保守区域和1个相对连续的可变区域,在可变区内存在大量正向重复和反向互补重复等特殊序列。 4.柑橘CBF基因启动子的烟草转化及初步鉴定在烟草转基因过程中,发现根癌农杆菌污染严重,同时在转基因检测中,GFP污染普遍。经过PCR初步鉴定,获得烟草转化枳pPtCBF序列阳性植株2株,转化橙pCsCBF序列阳性植株仅1株,转化柚pCgCBF序列阳性植株3株,转化粗柠檬pCjCBF_s序列阳性植株7株,转化效率明显偏低,最终结果还有待进一步检测核实。