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孵化后期外源二糖和谷氨酰胺调控肉鸭骨骼肌蛋白质代谢机制研究

陈伟  
【摘要】: 为满足小肠快速发育和机体频繁活动所需要的大量能量,孵化后期的家禽胚胎常常发生骨骼肌的大量降解,动员蛋白质产生的氨基酸来提供糖异生所需的底物和肠道发育需要的特异氨基酸。骨骼肌降解的结果可能导致出壳后骨骼肌生长的延缓。本研究以肉鸭胚胎为材料,研究孵化后期机体能量代谢和骨骼肌蛋白质代谢变化规律,来探讨孵化后期机体的能量状态和骨骼肌发育的关系;并运用胚蛋注射技术,为孵化后期肉鸭胚胎补充二糖、谷氨酰胺和β-羟-β-甲基丁酸,探讨家禽孵化后期营养干预对小肠发育及骨骼肌生长的调控作用及机制。本研究由4部分组成。 第一部研究孵化后期及出壳早期肉鸭能量状态、小肠发育及胸肌中蛋白质合成与降解变化,以探讨孵化后期机体能量状态、小肠发育与骨骼肌生长的关系。在孵化期22d (22E)、25d (25E)、出壳当天(0d)、出壳后3d (3d)、7d (7d),分别采集胸肌、肝脏、血样(n=10)和空肠(n=8)。分析空肠蔗糖酶和麦芽糖酶活性,对空肠作石蜡切片并度量肠绒毛高度;用碘显色法分析肝脏和胸肌中糖原浓度;对胸肌作石蜡切片并度量肌纤维束和肌纤维横截面积;用荧光定量PCR法检测胸肌中Atrogin-1和FoxO1基因mRNA表达丰度;采用Western Blot技术分析胸肌中p-AMPK (Thr172)、p-FoxO1 (Ser256)和p-S6K1 (Thr389)蛋白表达。结果发现:肝糖原和肌糖原浓度从22E到0d分别下降了58%和85%(P0.05),出壳后肝糖原浓度随时间而增加(P0.05)。血糖浓度从孵化期22d到出壳当天上升了135%(P0.05),出壳后随日龄而继续上升(P0.0001)。小肠重量和长度从孵化期22d到出壳当天分别上升352%(P0.0001)和48%(P0.05);出壳后7d,小肠重量和长度分别比出壳当天提高了500%和107%(P0.01)。相似地,空肠绒毛高度和麦芽糖酶活性从孵化期22d到出壳当天分别增加了1.5倍和12倍(P0.05);出壳后,空肠绒毛高度、蔗糖酶和麦芽糖酶活性随日龄显著上升(P0.05)。胸肌重量从孵化期22d到出壳当天下降了45%(P0.0001),出壳后随日龄而显著增加(P0.01)。胸肌的肌纤维束和肌纤维横截面积从孵化期22d到出壳当天分别显著下降了54%和50%(P0.05);出壳后肌纤维束和肌纤维横截面积随日龄而提高(P0.05)。胸肌中Atrogin-1 mRNA表达丰度从孵化期22d到出壳当天上调了74倍(P0.0001);出壳后7d, Atrogin-1 mRNA表达丰度下降到孵化期22d的水平。出壳当天,胸肌中FoxO1 mRNA表达丰度于比孵化期22d上调了5倍(P0.0001),而到7d时受到显著下调(P0.05)。从孵化期22d到出壳当天,胸肌中p-AMPK/AMPK下降了77.5%(P0.01);出壳后7d仍维持在较低水平。孵化期25d,胸肌中p-FoxO1/FoxO1于各阶段最低,而出壳后7d显著高于孵化期25d水平(P0.05)。从孵化期22d到出壳当天,胸肌中P-S6K1/S6K1下降了71.4%(P0.05);出壳后7d, p-S6K1/S6K1显著上升(P0.05)。本试验结果表明:肉鸭孵化后期小肠发育和能量动员加快;泛素系统所参与的骨骼肌蛋白质分解代谢增强;蛋白质合成受到抑制,从而导致了骨骼肌的负生长。 第二部分研究孵化后期补充二糖和丙氨酰-谷氨酰胺对肉鸭胚胎机体能量贮存的影响。本试验选择发育良好的胚蛋520枚,随机分为4组。在孵化期23d(23E),对3个试验组分别胚蛋注射以下营养物质:1)蔗糖+麦芽糖(DS);2)丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln);3)蔗糖+麦芽糖+丙氨酰-谷氨酰胺(DS+Ala-Gln),以不注射任何物质的空白组为对照。出壳后各处理分为10个重复,单栏饲养,提供相同的商业饲料。于孵化期25d(25E)、出壳当天(0d)、出壳后3d (3d)、7d (7d),各处理中取10只肉鸭称量体重后屠宰,分别采集胸肌、肝脏和血样(n=10)。检测肝脏和胸肌中糖原浓度、肝脏中葡萄糖-6-磷酸酶活性及血糖浓度。结果发现:孵化期25d,胚蛋注射DS和DS+Ala-Gln比对照组显著提高了肝糖原浓度(P0.05);出壳后3d,对照组和DS组肝糖原浓度显著高于Ala-Gln和DS+Ala-Gln组(P0.05)。孵化期25d, Ala-Gln和DS+Ala-Gln组的肌糖原浓度显著高于对照组(P0.05).DS和Ala-Gln组血糖浓度于出壳当天和出壳后3d显著高于对照组(P0.05)。孵化期25d,胚蛋注射DS、Ala-Gln和DS+Ala-Gln组肝脏中的葡萄糖-6-磷酸酶活性显著低于对照组(P0.05);而出壳后7d,DS和DS+Ala-Gln组中葡萄糖-6-磷酸酶活性显著高于对照组(P0.05)。相关分析表明,肉鸭肝糖原浓度与体重呈高度的正相关(r=0.809,P0.0001)。本试验结果表明:孵化后期DS和Ala-Gln的补充能够增加肉鸭胚胎肝脏和胸肌中糖原贮备,而补充Ala-Gln和DS+Ala-Gln降低了出壳后早期肝脏中糖原贮存。 第三部分研究了孵化后期补充能量底物和肠道调节物对肉鸭胚胎及出壳后早期小肠发育的影响。选择发育良好的胚蛋520枚平均分为4组。在孵化期23d(23E)对3个试验组分别注射:1)二糖(蔗糖+麦芽糖)(DS);2)二糖+谷氨酰胺(DS+Gln);3)二糖+β-羟-β-甲基丁酸(DS+HMB),以不注射任何物质的空白组为对照。出壳后各处理分为8个重复,试验各阶段以重复栏为单位,度量每周体重(共5周)。采取孵化期25d(25E)、出壳当天(0d)、出壳后3d(3d)和7d(7d)各处理空肠样品(n=8)。对空肠组织作石蜡切片和HE染色并进行形态学分析,测定空肠蔗糖酶、麦芽糖酶活性、DNA浓度和蛋白浓度。结果表明:相比对照组,孵化后期注射DS+HMB显著提高了肉鸭出壳重(平均提高1g)(P0.05)。4-7d阶段,DS+Gln组日增重显著高于对照组和DS组(P0.05),而DS组日增重显著低于对照组(P0.05);出壳后7d,DS+Gln组体重比对照组DS分别高8%和9%(P0.05).DS+HMB和DS+Gln组料肉比在4-7d阶段显著低于对照组(P0.05)。与对照组相比,胚蛋注射DS显著降低了出壳当天的小肠相对重和出壳后3d的小肠长度(P0.05),而提高了3d的空肠绒毛宽度和7d的肠绒毛表面积(P0.05)。在孵化期25d和出壳后3d,DS+Gln组肌层厚度比对照组分别高29%和48%(P0.05).DS组空肠蔗糖酶活性在孵化期25d、出壳当天、出壳后7d显著高于对照组(P0.05):DS+Gln和DS+HMB组蔗糖酶活性分别于出壳当天和出壳后7d显著高于对照组(P0.05)。本试验结果表明:孵化后期补充DS+Gln改善了出壳后肉鸭早期生长和小肠发育;而DS的补充不利于早期小肠发育和体增长;DS+HMB的补充表现出对肉鸭小肠发育和体增长表现出有限的改善效应。 第四部分探讨孵化后期补充二糖(DS)和丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)对肉鸭骨骼肌蛋白质合成与分解代谢的影响。本试验胚蛋注射同第二部分。于孵化期25d(25E)、出壳当天(0d)、出壳后3d(3d)和7d(7d),分别采集胸肌样品(n=10)。对胸肌作石蜡切片并度量肌纤维束和肌纤维横截面积,采用荧光定量PCR方法检测各组胸肌中Atrogin-1和FoxO1 mENA表达丰度,用Western Blot分析各组胸肌中AMPK、FoxO1、S6K1蛋白以及相应磷酸化蛋白的表达。结果发现:尽管各处理组间的肌纤维横截面积差异不显著(P0.05),但补充Ala-Gln显著提高了孵化期25d、出壳当天和出壳后3d的肌纤维束横截面积(P0.05),而DS的补充仅提高了出壳后3d的肌纤维束横截面积(P0.05)。孵化期25d,补充DS和Ala-Gln组胸肌中Atrogin-1 mRNA表达丰度显著低于对照组(P0.05);各试验组Atrogin-1 mRNA表达丰度出壳后3d均显著低于对照组(P0.05),而7d却显著高于对照组(P0.05)。各试验组胸肌中FoxO1 mRNA表达丰度出壳后3d显著高于对照组(P0.05),而7d显著低于对照组(P0.05)。孵化期25d,与对照组相比,补充DS显著降低了胸肌中p-AMPK的表达(P0.05),而补充Ala-Gln则显著提高了p-AMPK和p-FoxO1的相对表达量(P0.05);同时,在孵化期25d和出壳后3d,Ala-Gln组p-S6K1蛋白表达显著高于对照组(P0.05)。本试验结果表明:孵化后期补充DS和Ala-Gln,缓解了家禽胚胎和出壳早期骨骼肌中泛素参与的骨骼肌蛋白质降解,而Ala-Gln补充同时还提高了骨骼肌蛋白质的合成,促进了骨骼肌的早期生长,但其效应仅持续在出壳后较早阶段。 综合以上试验结果,本研究得出以下结论:孵化后期肉鸭胚胎肝脏和骨骼肌中糖原大量动员,小肠发育加快,机体处于能量紧缺状态。此时,骨骼肌中泛素-蛋白酶体参与的蛋白质降解途径增强,骨骼肌分解代谢加快,而蛋白质合成代谢受到抑制,骨骼肌呈现负增长。孵化后期补充二糖和谷氨酰胺的混合物可以调控肉鸭小肠早期发育和机体生长。二糖或丙氨酰胺-谷氨酰胺的补充能改善肉鸭胚胎和出壳后早期能量状态,缓解骨骼肌中蛋白质分解代谢,进而促进骨骼肌的早期生长。


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