收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

油菜细胞核雄性不育的细胞学研究以及育性相关基因的克隆与功能分析

万丽丽  
【摘要】: 甘蓝型油菜细胞核雄性不育是油菜杂种优势利用的重要途径,它的优点表现在相对于细胞质雄性不育更为稳定彻底的不育性状,不受恢保关系限制而易获得强优势组合。虽然细胞核雄性不育已经得到广泛的应用,但其雄性不育基因作用的机理还没有被揭示。雄性不育性作为一个复杂的性状关系到雄蕊形态建成、花粉囊中孢子体组织和配子体组织分化过程的基因调控。在这个过程中任何一个基因突变都会影响花药正常发育。随着模式植物拟南芥中与育性相关基因功能注释信息的公布,我们能从生理生化、细胞形态和分子调控等方面更好地理解这些基因在控制育性网络中的作用和相互之间的关系。从而能够从细胞学和分子作用水平深入探索甘蓝型油菜细胞核雄性不育的花粉败育机理,为最终实现人工雄性不育垫定基础。 基于以上需要,本研究开展了以下3个方面的研究工作: 1.利用光学显微镜(石蜡切片,半薄切片)和电子显微镜(扫描电镜,透射电镜)分别对显性细胞核雄性不育Rs1046A、隐性细胞核雄性不育9012A以及正常可育植株花药的外部形态和切片进行观察,从而确定败育时期和败育特征。 2.从Rs1046可育和不育的花药构建的差减文库中筛选到差异表达的基因BnQRT3和BnATA20,在甘蓝型油菜中获得它们的全长序列,并且利用生物信息学软件分析基因的序列。通过RT-PCR和原位杂交,在Rs1046A和Rs1046B的各个组织中研究这两个基因的表达时空特征。 3.通过基因敲除的方法研究BnQRT3和BnATA20在甘蓝型油菜花粉囊发育过程中的作用。同时在甘蓝型油菜的各个组织中检测这两个基因的启动子的表达状况。 主要结论如下: 1.细胞学研究确定了这两种细胞核雄性不育的主要败育时期和特征:显性细胞核雄性不育发生败育在花粉母细胞时期,表型为花粉母细胞不能进行正常的减数分裂,不能进一步地发育成四分体,而是继续发育形成“拟小孢子”。另外不育材料的绒毡层细胞是以“逐渐紧缩”的方式瓦解,不同于正常可育的绒毡层细胞的“均匀网状式”降解的模式。隐性细胞核雄性不育败育发生于减数分裂后形成四分体时期,特征为绒毡层细胞过度生长,液泡巨噬化,挤压药室,同时不能分泌出胼胝质酶来降解包裹四分体的胼胝质,最终四分体逐渐瓦解。 2.从Rs1046A和Rs1046B构建的差减文库中筛选到两个EST:2-C15 (GenBank:EE392320)和1-H16 (GenBank:EE392282)。根据已知序列通过5’和3'RACE和Genome Walking的方法获得BnQRT3(2-C15)的cDNA和基因组序列,BnQRT3基因最大开放阅读框为1431bp编码了476aa。TargetP1.1预测BnQRT3蛋白为分泌蛋白。将BnQRT3基因编码的蛋白与已知的植物PGs做树形图分析进化关系,发现其编码的蛋白属于花蕾中表达的基因编码的PGs。通过电子克隆和Genome Walking相结合的方法获得BnATA20 (1-H16)基因的1559bp cDNA和2907bp的基因组序列。BnATA20基因编码的蛋白质中富含甘氨酸重复序列(GXGX)n,所以被称为甘氨酸富集蛋白。 3.对BnQRT3在Rs1046AB中的表达模式研究表明它在花粉母细胞时期至二核花粉粒时期的绒毡层细胞中表达,另外在可育材料的四分体、小孢子和成熟花粉粒中表达。BnATA20基因只在可育材料的四分体时期到二核花粉粒时期的绒毡层细胞中表达。 4.对BnQRT3反义抑制载体和RNAi载体转化获得的抗性植株中的不育单株进行DNA、外观形态、细胞学和基因表达水平的检测。反义抑制后所得拟南芥的8个阳性单株中有2个单株表现为雄蕊彻底败育。RNAi转化的9个阳性单株中有3株的大多数花中的雄蕊彻底败育,只有少数花中的雄蕊中存在微粉,但是花粉的外壁结构异常,人工授粉后发现不结实。在抑制和干涉载体转化的甘蓝型油菜的不育株中,BnQRT3在花药中表达水平下降。反义抑制转化后阳性植株中有12个单株的所有雄蕊表现为瘦小干瘪,不能产生花粉。而RNAi转化后阳性单株中有4个单株出现不结实的现象。观察发现其中3个单株的所有花中雄蕊彻底败育,只有一个单株出现少数的花中的雄蕊能够散粉,将其授予可育材料15天后,与正常可育单株相比角果短小。光学显微镜观察得出,BnQRT3RNAi所得的彻底败育的花粉囊与BnQRT3反义抑制后出现的败育表型相同,只是能够产生花粉的花药经过醋酸洋红染色,以及花粉管萌发实验证明极少数的花粉能够着色,并且延迟萌发。BnQRT3抑制和RNAi得到的不育单株的子房发育都是正常的。通过石蜡切片和透射电镜观察彻底败育的花粉囊发现绒毡层细胞发育严重受阻,没有孢粉素和脂类物质沉积在小孢子的外壁上,小孢子内部的胞质收缩,外观形态上严重变形,小孢子聚集紧缩在一起直至瓦解。 5.在BnATA20反义抑制载体转化甘蓝型油菜得到的阳性不育单株的雄蕊中发现,BnATA20基因在转录水平上受到明显抑制。不育花蕾中的花药皱缩无粉。细胞学观察发现绒毡层细胞在四分体后期就已经开始瓦解,其胞质中没有脂类物质的合成,小孢子被变形的绒毡层包围不能再进一步地发育成花粉粒。 6.分析基因BnQRT3和BnATA20基因5’端上游非编码序列,发现其中含有大量的调控元件。GUS染色结果表明BnQRT3-Promoter是花器官中特异表达的启动子,转化植株的雄蕊、子房、花萼、花瓣和花丝中GUS表达很强;BnATA20-Promoter为花药中特异表达的启动子。并且这两个基因的启动子都是与维管组织相关的受伤诱导型的,当植株中各个组织受到外界机械损伤时,在受伤的部位如叶片支脉和主脉,茎,花序与主茎分支处都能检测到GUS的表达活性。在BnATA20基因的启动子区域存在着维管组织中特异表达基因的受伤诱导型调控序列如W-box,W1-box和GCbox。但是在BnQRT3基因的启动子区域却不存在已知的维管组织特异表达的调控序列。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张雪梅;董振生;;甘蓝型油菜隐性上位互作核不育材料1665花药败育的细胞学研究[J];西北植物学报;2009年01期
2 陈瑛;甘蓝型油菜NCa雄性不育系细胞形态学研究[J];武汉教育学院学报;1998年06期
3 官春云,李,王国槐,陈社员,袁晏松;化学杂交剂诱导油菜雄性不育机理的研究 Ⅱ.KMS-1对甘蓝型油菜育性的影响[J];中国油料作物学报;1998年03期
4 盛晓燕,刘贵华,蔡明,秦选佑;甘蓝型油菜雄性不育的遗传研究Ⅳ.甘蓝型油菜异核型雄性不育材料减数分裂过程观察[J];中国油料作物学报;1997年01期
5 黄华磊;雷波;柴友荣;;甘蓝型油菜透明种皮12(TT12)基因家族反义抑制植物表达载体的构建[J];中国农学通报;2007年05期
6 危文亮;王汉中;刘贵华;;甘蓝型油菜NCa细胞质雄性不育系统花药败育前期的基因差异表达[J];作物学报;2007年10期
7 朱有焕;对鄂西南高山地区甘蓝型油菜拔高种植问题的探讨[J];湖北农业科学;1982年07期
8 湖南省农科院作物所油菜室杂交油菜课题组;甘蓝型油菜萝卜细胞质不育系恢复原的发现[J];湖南农业科学;1985年02期
9 何希树;;甘蓝型油菜病毒病的药剂治蚜防病研究[J];安徽农业科学;1987年01期
10 张瑞茂,侯国佐,朱永生;甘蓝型油菜芽粒形成的时期及对发芽出苗率影响的研究[J];中国油料作物学报;1991年04期
11 庞红喜,黄继英;多效唑对甘蓝型油菜抗寒性的生理效应研究[J];西北农业学报;1992年03期
12 李仕琼;杨弘远;周嫦;;甘蓝型油菜和紫菜苔花粉原生质体的大量分离[J];Journal of Integrative Plant Biology;1992年05期
13 潘大仁,FriedtW;甘蓝型油菜与萝卜属间杂种的获得及其酶学分析[J];福建农业大学学报;1997年04期
14 戚存扣,高冠军,浦惠明,傅寿仲,仲裕泉;甘蓝型油菜二体附加系92Ⅰ 1096附加染色体的遗传研究[J];中国油料作物学报;2000年01期
15 刘忠松,官春云,李木旬,陈社员,王国槐;甘蓝型油菜与芥菜型油菜种间杂交研究[J];中国油料作物学报;2001年02期
16 蒋梁材,蒲晓斌,张启行,陈放;甘蓝型油菜细胞质雄性不育材料NEA的发现与遗传研究[J];中国农业科学;2002年01期
17 胡张华,郎春秀,刘智宏,黄锐之,吴关庭,陈笑芸,陈锦清;甘蓝型油菜下胚轴原生质体培养再生植株[J];浙江农业学报;2002年05期
18 刘雪平,刘志文,涂金星,陈宝元,傅廷栋;甘蓝型油菜小孢子培养技术的几项改进[J];遗传;2003年04期
19 王瑞,李加纳;甘蓝型油菜雄性不育完全保持的途径[J];中国农学通报;2004年01期
20 付忠;;甘蓝型油菜常规育种研究[J];青海大学学报(自然科学版);2006年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 唐志康;黄荣仙;田露申;郭世星;蒋良材;蒲晓斌;牛应泽;;“化杀灵WP1”诱导的甘蓝型油菜雄性败育花蕾中SSH文库的构建及筛选[A];中国作物学会50周年庆祝会暨2011年学术年会论文集[C];2011年
2 沈金雄;傅廷栋;杨光圣;;甘蓝型油菜杂种优势预测的研究[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
3 陆光远;伍晓明;陈碧云;高桂珍;许鲲;;甘蓝型油菜新型雄性不育突变体的花器官形态特征[A];湖北省遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2004年
4 许本波;李加纳;张学昆;谢伶俐;柴友荣;;甘蓝型油菜查尔酮异构酶基因的克隆和表达研究[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年
5 邓晓玲;孔维文;冯震;郭明;李华平;;甘蓝型油菜中NPR1基因的克隆、载体构建及其转化的研究[A];中国植物病理学会2004年学术年会论文集[C];2004年
6 田露申;曾德志;郭世星;万成燕;李一路;张星星;柳丽;邓武明;文凤君;陈胜荣;余青青;牛应泽;;甘蓝型油菜遗传图谱的构建及白花性状QTL定位[A];中国作物学会50周年庆祝会暨2011年学术年会论文集[C];2011年
7 刘忠松;官春云;陈社员;;油菜芥甘种间杂交育种程序研究和种质创新[A];2004’中国作物学会学术年会文集[C];2004年
8 陈凤祥;胡宝成;李强生;侯树敏;吴新杰;费维新;;甘蓝型油菜隐性上位互作核不育的发现、研究与利用[A];2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2003年
9 付春华;刘建民;李运涛;李红;甘露;余龙江;栗茂腾;;AA和EPA合成关键酶基因的克隆及对甘蓝型油菜的遗传转化研究[A];全国植物分子育种研讨会摘要集[C];2009年
10 徐芳森;王运华;;甘蓝型油菜硼素营养遗传性差异的研究进展[A];青年学者论土壤与植物营养科学——第七届全国青年土壤暨第二届全国青年植物营养科学工作者学术讨论会论文集[C];2000年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 万丽丽;油菜细胞核雄性不育的细胞学研究以及育性相关基因的克隆与功能分析[D];华中农业大学;2010年
2 肖勇;新型甘蓝型油菜A~rA~rC~cC~c基因库的创建与评估[D];华中农业大学;2010年
3 雷绍林;甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnMS2的精细定位与候选基因鉴定[D];华中农业大学;2009年
4 徐芳森;甘蓝型油菜硼营养高效的生理机制和遗传基础研究[D];华中农业大学;2000年
5 董军刚;甘蓝型油菜温敏细胞质雄性不育系417S选育与鉴定[D];西北农林科技大学;2010年
6 梅家琴;甘蓝与甘蓝型油菜C亚基因组遗传关系调查及甘蓝抗菌核病QTL定位[D];西南大学;2011年
7 刘超;甘蓝型油菜矮杆基因Bnrga-ds的克隆和功能分析[D];华中农业大学;2010年
8 张海伟;甘蓝型油菜磷高效的生理机制研究[D];华中农业大学;2009年
9 马朝芝;甘蓝型油菜遗传多样性和杂种优势的研究[D];华中农业大学;2002年
10 王晶;甘蓝型油菜中控制开花的主效QTL簇的解析和“成花素”基因家族的克隆及分析[D];华中农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 谭茂玲;甘蓝型油菜转基因体系的建立与PWY86及TLW10表达载体的遗传转化[D];西南大学;2011年
2 李海渤;我国甘蓝型油菜双低品种(系)的遗传多样性评估[D];华中农业大学;2001年
3 吴建忠;甘蓝型油菜结实相关性状分析及QTL定位[D];华中农业大学;2010年
4 肖庆生;甘蓝型油菜抗旱相关基因的表达分析[D];中国农业科学院;2011年
5 杨成军;甘蓝型油菜CHSA、CHSB基因以及WRKY44同源基因片断的克隆与序列分析[D];西南农业大学;2004年
6 王轶;甘蓝型油菜“蜀杂九号”防御素基因全长cDNA的克隆与原核表达[D];四川大学;2005年
7 夏秀云;甘蓝型油菜雄性不育相关基因BnATA20功能验证[D];华中农业大学;2011年
8 洪晓敏;甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育相关基因2-I05功能研究[D];华中农业大学;2009年
9 廖问陶;诸葛菜(Orychophragmus violaceus)及甘蓝型油菜(Brassica napus)Toc33基因编码区的克隆与分析[D];四川大学;2003年
10 胡永敏;甘蓝型油菜细胞质雄性不育系1575A的细胞学观察及其恢复基因的分子标记[D];西北农林科技大学;2012年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 王代林;四川科技人员发现植物新型耐热基因[N];四川日报;2009年
2 记者 毛翠香;青杂3号杂交油菜鼓了农民的“钱袋子”[N];青海日报;2010年
3 李山;茉莉酸具有调控花蜜生产功效[N];科技日报;2010年
4 记者 寇俊山;全力以赴抓好春季农牧业生产[N];青海日报;2010年
5 ;华皖油2号[N];农民日报;2004年
6 农保伴;288个新品种获得授权[N];农资导报;2009年
7 戴铁生;要种就种“双低”油菜[N];湖南科技报;2004年
8 记者 周波;将TR1基因“转移”到水稻中可提高水稻抗高温能力[N];成都日报;2009年
9 记者徐春成;市农业局对全市麦油旱情开展调查[N];铜川日报;2009年
10 本报记者 李禾;冷焦水循环处理:100%回收、100%再利用[N];科技日报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978