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疏肝健脾、化痰活血方对非酒精性脂肪性肝病细胞模型线粒体损伤的干预作用

曾兰  
【摘要】:目的 成功建立NAFLD细胞模型,并观察疏肝健脾、化痰活血方对NAFLD体外模型肝细胞凋亡、线粒体膜流动性、膜电位水平、能量代谢、脂质过氧化等的影响,探讨其对NAFLD体外模型肝细胞损伤的保护作用及其机制。 方法 将培养的幼鼠肝细胞分为正常组、造模组。正常组细胞用含20%FBS的DMEM-F12培养液;造模组在培养液中加入15μg/ml软脂酸作用5天。进行台盼蓝染色计算肝细胞存活率,并用倒置显微镜观察细胞贴壁情况及形态改变。模型成功后分为3组,即NAFLD细胞模型组(模型组),水飞蓟素治疗组(对照组)和中药血清治疗组(中药组),并分别用水飞蓟素,疏肝健脾、化痰活血方含药血清干预,化学比色法检测肝细胞活性、甘油三酯水平(TG)水平、肝细胞线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Cyto-Ox活性,SOD、MDA、NO、GSH含量,流式细胞仪检测肝细胞凋亡率,Western Blot法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达,荧光分光光度计检测肝细胞线粒体膜流动性、膜电位水平。 结果 1.对NAFLD体外模型细胞活性和TG的影响 与正常组比,模型组细胞存活率明显减少(P0.05),中药组和水飞蓟素组细胞存活率比模型组显著升高(P0.01),与正常组比较无差异(P0.05)。与正常组比,模型组TG含量明显升高(P0.01),中药组和水飞蓟素组TG含量比模型组显著降低(P0.01),中药组TG含量与水飞蓟素组比较有显著差异(P0.05)。 2.对NAFLD体外模型肝细胞凋亡的影响 与正常组比,模型组凋亡率和ODA540值均明显升高(P0.01)。与模型组比,中药组和水飞蓟素组凋亡率和ODA540值均均明显降低,有统计学差异(P0.01 or P0.05),中药组凋亡率与水飞蓟素组比较有显著性差异(P0.01),中药组ODA540值与水飞蓟素组比较也有统计学差异(P0.05)。 与正常组比,模型组Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P0.01)。与模型组比,中药组Bcl-2蛋白表达水平升高,有显著性差异(P0.01),中药组与水飞蓟素组比较有差异(P0.05)。与正常组比,模型组Bax和Caspase-3蛋白表达明显升高(P0.01)。与模型组比,中药组和水飞蓟素组均降低,有显著性差异(P0.01),中药组与水飞蓟素组比较有显著性差异(P0.01)。 3.对NAFLD体外模型肝细胞线粒体膜流动性、膜电位水平的作用 与正常组比,模型组膜电位水平和膜流动性均明显降低(P0.01)。与模型组比,中药组和水飞蓟素组膜电位水平和膜流动性均升高,有显著性差异(P0.01 or P0.05),中药组膜流动性与水飞蓟素组比较有差异(P0.05)。但中药组膜电位水平与水飞蓟素组比较无差异(P0.05)。 4.对NAFLD体外模型肝细胞线粒体能量代谢的影响 与正常组比,模型组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量和Cyto-Ox活性均明显减少(P0.01),中药组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量和Cyto-Ox活性较模型组显著升高(P0.01),但水飞蓟素Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量与模型组比较无显著性差异(P0.05)。中药组Ca2+-ATP酶含量较水飞蓟素组有显著性差异(P0.01),达到正常组水平(P0.05),Na+-K+-ATP酶和Cyto-Ox活性与水飞蓟素组比较无显著性差异(P0.05)。 5.对NAFLD体外模型肝细胞线粒体脂质过氧化的影响 与正常组比,模型组细胞线粒体MDA含量明显升高(P0.01),水飞蓟素和中药组MDA水平明显低于模型组(P0.01),但水飞蓟素和中药组之间无显著性差异(P0.05)。SOD、NO和GSH含量,模型组较正常组均显著降低(P0.01),中药组能明显升高SOD、NO和GSH含量,与模型组比有显著性差异(P0.01)。中药组NO和GSH水平与水飞蓟素组有差异(P0.05),水飞蓟素组GSH水平与模型组比无差异(P0.05)。 结论 1.肝郁脾虚、痰瘀交阻是NAFLD发病早期的基本病机; 2.疏肝健脾、化痰活血方能有效降低NAFLD体外模型TG水平,提高损伤的细胞活性,减轻肝细胞损伤; 3.疏肝健脾、化痰活血方能有效降低NAFLD体外模型肝细胞凋亡率,其机制可能与调节Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达有关。 4.疏肝健脾、化痰活血方能有效提高NAFLD体外模型肝细胞能量供应,改善细胞水平的能量代谢障碍,提高肝细胞线粒体抗氧化水平,改善线粒体脂质过氧化损伤状态及线粒体膜流动性和膜电位损伤,可能是其减轻肝细胞损伤的机制之一。


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