辛温通阳中药葱白提取物对动脉粥样硬化大鼠IL-6/STAT3信号通路的调节作用及机制研究

【摘要】：目的 通过辛温通阳中药和活血化瘀中药、化痰中药、通络中药、通下中药治疗动脉粥样硬化的对比研究,探讨辛温通阳中药葱白提取物对动脉粥样硬化大鼠IL-6/STAT3信号通路的调节作用及机制研究,初步揭示辛温通阳中药治疗AS的生物学基础。 方法 本研究选用健康纯种SD雄性大白鼠,体重为200-230克,3-4月龄120只,随机分为正常对照组、空白模型组、葱白提取物组、薤白提取物组、桂枝提取物组、干姜提取物组、附子提取物组、丹参提取物组、瓜蒌提取物组、地鳖虫提取物组、大黄提取物组、普罗布考组,每组10只。参照郭延松等的方法制备动脉粥样硬化模型。适应性喂养一周后,正常对照组喂基础饲料和普通自来水,模型组及各治疗组以高脂饲料(2%胆固醇、0.5%胆酸钠、3%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶和94.3%的基础饲料)和维生素D3粉剂(1.25×106u/kg)喂养。并于实验开始时于右下肢肌肉注射维生素D3针剂(3×105u/kg体重),以后每隔30天重复注射一次。于第7天除正常对照组外,其余各组行大鼠主动脉内膜球囊损伤术 于造模后第3天开始给药,给药体积为2ml/kg,正常对照组和空白模型组给予生理盐水。葱白提取物组按20mg·kg-1给药、薤白提取物按20mg·kg-1给药、桂枝提取物按15mg·kg-1给药、干姜提取物按10mg·kg-1给药、附子提取物按20mg·kg-1给药、丹参提取物按10mg·kg-1给药、瓜蒌提取物按10mg·kg-1给药、地鳖虫提取物按10mg·kg-1给药、大黄提取物按10mg·kg-1给药、普罗布考组按10mg·kg-1给药；每日1次,连续给药16周。 于实验16周末禁食16h后,麻醉动物,腹主动脉取血后,分离颈总动脉,在主动脉弓起始段取0.5cm主动脉标本,10%多聚甲醛溶液固定12小时；打开腹腔,分离血管外脂肪组织,沿主动脉背部正中线剪开,生理盐水冲洗,-80℃低温冰箱保存备用；取血5ml留置2管,分别分离血清,保存在-80℃低温冰箱备用。 通过HE染色、油红O染色分析病理变化和脂质沉积情况；用实时荧光定量PCR技术、Western Blot检测TLR4、LXR在AS大鼠腹主动脉中的表达；免疫组化法检测JNK/P-JNK、P38MAPK/p-p38 MAPK在AS大鼠腹主动脉中的表达,用ELISA法检测ERK1/2/P-ERK1/2的表达,用Western Blot检测P38MAPK/p-p38 MAPK在AS大鼠腹主动脉中的表达；用实时荧光定量PCR技术检测AS大鼠腹主动脉血管AGTR1mRNA的表达；采用免疫组化法、Western Blot检测AS大鼠腹主动脉NFκB P65/p-NFκB P65的表达；用ELISA法、免疫组化法、实时荧光定量PCR技术检测AS大鼠腹主动脉血管IL-6的表达；Western Blot检测AS大鼠腹主动脉JAK1/p-JAK1、STAT3/p-STAT3的表达。 结果 1.对AS大鼠动脉血管壁组织形态的影响将主动脉标本用70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水,二甲苯透明,蜡块包埋,制成石蜡切片(5μm)、HE染色,观察动脉管壁形态学变化。 HE染色结果提示,空白模型组大鼠血管中膜及外膜分界不清,中膜增生明显,内膜增厚,不光滑,内皮细胞损伤脱落且连续缺失,可见斑块突出管腔,斑块内含有大量的巨噬细胞,平滑肌细胞和胶原含量相对较少；葱白提取物组内膜增厚程度相对较轻,内皮细胞排列较整齐,弹力膜连续无断裂,斑块亦无破裂；薤白提取物组中膜增生相对较轻,内皮细胞排列相对整齐,弹力膜可见断裂,亦见斑块破裂；附子提取物组、丹参提取物组和地鳖虫提取物组见胶原增生明显,中膜增厚,结构不清晰,丹参组相对较轻；桂枝提取物组见内膜增厚,不光滑,内皮细胞损伤脱落；干姜提取物组外膜明显增厚,结构不清晰,内皮细胞损伤脱落,斑块破裂；瓜蒌提取物组中膜增生明显,内膜不光滑,内皮细胞损伤脱落,见炎性浸润；大黄提取物组增生不明显,内膜相对光滑,内皮细胞完整,平滑肌细胞排列整齐；普罗布考组增生不明显,内膜光滑,内皮细胞完整且没有破损,但见少许胶原增生。 将固定的腹主动脉标本用蒸馏水冲洗后,‘用油红0染色,分析组织切片中的中性甘油三脂,脂质以及脂蛋白等脂质状况。 油红0进行染色结果显示,模型大鼠腹主动脉血管壁有大量的脂质沉积,血管壁脂肪含量显著增加。普罗布考组早期干预治疗具有明显的降脂作用,脂质沉积最少。和其它干预组比较,通阳中药葱白提取物组和薤白提取物组血管壁中脂质沉积也明显减少,葱白提取物组减少更明显。化痰中药瓜蒌提取物组有大量脂质沉积。 2.TLR4、LXR在AS大鼠腹主动脉中的表达正常对照组比较空白模型组大鼠腹主动脉TLR4蛋白水平显著升高；与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可降低TLR4蛋白水平,各干预组抑制率分别为：干姜提取物组为73.11%、大黄提取物组为71.77%、地鳖虫提取物组为71.29%、普罗布考组为68.56%、桂枝提取物组为54.03%、瓜蒌提取物组为49.70%、附子提取物组为49.11%、葱白提取物组为48.38%、丹参提取物组为47.31%、薤白提取物组为40.19%。 与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉TLR4mRNA显著升高,扩增倍数为57.27；与空白模型大鼠组比较,各干预组TLR4mRNA表达均有降低,各组基因扩增倍数的变化为：桂枝提取物组为0.42、地鳖虫提取物组为0.96、瓜蒌提取物组为4.03、丹参提取物组为5.97、普罗布考组为6.68、薤白提取物组为7.28、干姜提取物组为10.31、附子提取物组为16.98、葱白提取物组为37.33、大黄提取物组为52.81。 与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉LXR蛋白显著降低；与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可升高LXR蛋白水平,各干预组增长率分别为：地鳖虫提取物组为212.64%、瓜蒌提取物组为205.73%、薤白提取物组为187.90%、干姜提取物组为147.31%、桂枝提取物组为136.91%、丹参提取物组为94.00%、附子提取物组为92.83%、葱白提取物组为67.60%、大黄提取物组为55.92%、普罗布考组为42.36%。 与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉LXRmRNA明显降低,扩增倍数为1.00；与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可升高LXRmRNA水平,各干预组增长率分别为：薤白提取物组为11.12、葱白提取物组为9.40、地鳖虫提取物组为7.16、干姜提取物组为2.11、丹参提取物组为1.52、普罗布考组为1.22、桂枝提取物组为0.81、瓜蒌提取物组为0.69、大黄提取物组为0.56、附子提取物组为0.47。 3.对AS大鼠腹主动脉JNK/P-JNK、ERK1/2/P-ERK1/2、P38MAP K/p-p38MAPK表达的影响磷酸化前,与正常对照组比较,空白模型组大鼠腹主动脉JNK表达显著增高,各干预组对JNK的抑制率分别为：瓜蒌提取物组为77%、干姜提取物组为74%、附子提取物组为74%、薤白提取物组为72%、桂枝提取物组为64%、地鳖虫提取物组为65%、葱白提取物组为63%、大黄提取物组为55.92%、丹参提取物组为51%、普罗布考组为42.36%；磷酸后,与正常对照组比较,空白模型组大鼠腹主动脉P-JNK表达显著增高；与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可降低P-JNK水平,各干预组抑制率分别为：瓜蒌提取物组为82.30%、大黄提取物组为71.92%、桂枝提取物组为71.78%、附子提取物组为70.09%、普罗布考组为67.91%、薤白提取物组为67.77%、丹参提取物组为67.71%、葱白提取物组为67.37%、干姜提取物组为66.63%、地鳖虫提取物组60.11%。 磷酸化前,与正常对照组比较,空白模型组大鼠血清ERK1/2表达显著增高,各干预组对ERK1/2的抑制率分别为：地鳖虫提取物组46.47%、附子提取物组为40.70%、干姜提取物组为37.86%、瓜蒌提取物组为32.05%、丹参提取物组为28.41%、大黄提取物组为27.50%、薤白提取物组为25.62%、桂枝提取物组为24.47%、葱白提取物组为13.29%、普罗布考组为12.70%；磷酸后,与正常对照组比较,空白模型组大鼠腹主动脉P-ERK1/2表达显著增高；、与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可降低P-ERK1/2水平,各干预组抑制率分别为：丹参提取物组为83.53%、附子提取物组为76.91%、大黄提取物组为73.09%、瓜蒌提取物组为65.46%、地鳖虫提取物组59.64%、桂枝提取物组为59.44%、薤白提取物组为53.62%、干姜提取物组为46.98%、葱白提取物组为42.57%、普罗布考组为34.54%。 磷酸化前,与正常对照组比较,空白模型组大鼠血清P38MAPK表达显著增高,各干预组对P38MAPK的抑制率分别为：地鳖虫提取物组46.47%、附子提取物组为40.70%、干姜提取物组为37.86%、瓜蒌提取物组为32.05%、丹参提取物组为28.41%、大黄提取物组为27.50%、薤白提取物组为25.62%、桂枝提取物组为24.47%、葱白提取物组为13.29%、普罗布考组为12.70%；磷酸后,与正常对照组比较,空白模型组大鼠腹主动脉p-p38MAPK表达显著增高；与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可降低p-p38MAPK水平,各干预组抑制率分别为：附子提取物组为82%、干姜提取物组为78%、普罗布考组为76%、桂枝提取物组为68%、大黄提取物组为67%、丹参提取物组为43%、地鳖虫提取物组40%、薤白提取物组为25%、瓜蒌提取物组为27%、葱白提取物组为17%。 4、对AS大鼠腹主动脉AGTR1表达的影响与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉AGTR1mRNA表达显著升高；与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可升高AGTR1mRNA水平,各干预组扩增倍数分别为：薤白提取物组为11.12、葱白提取物组为9.40、地鳖虫提取物组7.16、干姜提取物组为2.11、丹参提取物组为1.52、普罗布考组为1.22、桂枝提取物组为0.81、瓜蒌提取物组为0.69、大黄提取物组为0.56、附子提取物组为0.47。 5.对AS大鼠腹主动脉NFκBP65/p-NFκB表达的影响与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉p-NFκB P65表达明显增高(P0.01),干预治疗后,各给药组均可以降低p-NFκBP65磷酸化程度。组间比较,普罗布考组作用最好,通下中药大黄提取物组次之,其余各组抑制磷酸化的作用依次是活血化瘀中药丹参提取物、通络中药地鳖虫提取物、通阳中药葱白提取物、通阳中药薤白提取物、化痰中药瓜蒌提取物、通阳中药桂枝提取物和通阳中药附子提取物。 与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉p-NFκBP65含量显著降低(P0.05)；与空白模型组比较,通阳中药葱白提取物和薤白提取物磷酸化程度升高,普罗布考组、通下中药大黄提取物和化痰中药瓜蒌可以明显降低磷酸化水平,通阳中药干姜提取物和桂枝提取物次之,通阳中药附子提取物和活血化瘀中药丹参提取物无明显改善。 6.对AS大鼠IL-6表达的影响与正常对照组比较,模型组大鼠IL-6值明显升高(P0.01)；与空白模型组比较,通阳中药葱白提取物、桂枝提取物组、干姜提取物组、薤白提取物组、通下中药大黄提取物组和普罗布考组IL-6水平明显降低(P0.01),活血化瘀中药丹参提取物组、通阳中药附子提取物、化痰中药瓜蒌提取物和通络中药地鳖虫提取物组均没有显著差异(P0.05),其余各组均有明显降低,具有统计学意义(P0.01)；和大黄提取物组比较,没有显著差异(P0.05)。 空白模型大鼠腹主动脉血管IL-6的表达明显升高；与空白模型组比较,各治疗组均可降低IL-6的水平(P0.01)；通络中药地鳖虫提取物降低最为显著,其余各组依次为：化痰中药瓜蒌提取物、通阳中药附子提取物、通阳中药薤白提取物、活血化瘀中药丹参提取物、通阳中药葱白提取物、通阳中药干姜提取物、普罗布考、通阳中药桂枝提取物；普罗布考作用和通阳中药桂枝提取物没有显著差异。 空白模型大鼠腹主动脉血管IL-6mRNA的表达明显升高；与模型组比较,各治疗组均可降低IL-6的水平(P0.05,P0.01)；化痰中药瓜蒌提取物和通下中药大黄提取物作用最明显,其余各组依次排序为：通阳中药干姜提取物、通阳中药附子提取物、通阳中药葱白提取物、普罗布考。 7.对AS大鼠腹主动脉JAK1/p-JAK1、STAT3/p-STAT3表达的影响与正常对照组比较,空白模型组大鼠腹主动脉p-JAK1水平显著提高(P0.01)；与空白模型组比较,各干预治疗组均可显著降低p-JAK1水平,其中通阳中药干姜提取物组效果最好,其余各组的作用依次是：通阳中药干姜提取物组、通阳中药薤白提取物组、通下中药大黄提取物组、活血化瘀中药丹参提取物组、普罗布考组、通阳中药桂枝提取物组、化痰中药瓜蒌提取物组、通络中药地鳖虫提取物组、通阳中药葱白提取物组。 与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉p-STAT3水平明显降低(P0.01)；与空白模型组比较,通阳中药葱白提取物p-STAT3水平明显升高,其他各组升高p-STAT3的作用依次为,通阳中药薤白提取物次之,活血化瘀中药丹参提取物、化痰中药瓜蒌提取物、通络中药地鳖虫提取物、通下中药大黄提取物作用相当,通阳中药桂枝提取物作用最小。 结论 1.辛温通阳中药葱白防治AS的炎症免疫机制主要与激活AngⅡ及受体AGTR1mRNA表达,影响JAK2/STAT3信号转导通路有关。 2.辛温通阳中药葱白防治AS的非炎症免疫机制主要通过降低TLR4及TLR4mRNA的水平,升高LXR及LXRmRNA,维持二者之间的平衡,抑制MAPKS家族亚族的JNK、p38MAPK、ERK1/2的磷酸化,作用于和转录因子NFκB,引起瀑布式反应,促进炎症因子IL-6的分泌,影响JAK2/STAT3信号转导通路。 3.辛温通阳中药葱白提取物、薤白提取物、桂枝提取物、干姜提取物、附子提取物,活血化瘀中药丹参提取物,化痰中药瓜蒌提取物,通络中药地鳖虫提取物和通下中药大黄提取物均可以影响IL-6/STAT3信号通路中相关的细胞因子的表达,具有防治AS的作用。但是由于作用环节和作用靶点的不同,药物成分的复杂性,对其整体优势的评价还有待进一步深入研究。 4.中药性味功效之间的关系对药物的药效及机制的影响各不相同,在多个方面发现一些有价值的现象,具有很好的研究价值,其机制有待于进一步深入研究。