苦丁茶的降血糖活性物质基础与作用机理研究

【摘要】：苦丁茶（Ilex kudincha C. J. Tseng）是冬青科（Aquifoliaceae）冬青属乔木植物的干燥嫩叶，主产于湖南、湖北、广东、广西等省，历代本草均有记载，有长期的临床应用基础，已经成为治疗心血管相关疾病、降血脂、降血糖等的常用辅助治疗药物，是药用植物研究的热点。本课题以苦丁茶调节糖脂代谢紊乱为研究内容，以降血糖、降血脂药理活性为基础，以传统的植物化学分离模式指导并跟踪，直至发现并确定苦丁茶降血糖、降血脂的活性成分，并利用液质联用（LC-MS/MS）技术对活性成分进行结构鉴定，同时从分子生物学的角度对其调节糖脂代谢紊乱的作用机理进行了研究。 本课题首先从苦丁茶水煎液对二型糖尿病小鼠降血糖活性的研究开始，采用高脂饲料(10%蛋黄，10%猪油，1%胆固醇，0.2%胆盐，78.8%基础饲料)配合低剂量注射四氧嘧啶(90mg·kg-1)的方法建立二型糖尿病小鼠模型。以苦丁茶水煎液10g·kg-1·d-1（相当于苦丁茶生药材质量）的剂量灌胃治疗1个月，研究苦丁茶水煎液对二型糖尿病小鼠体重的影响以及对小鼠血清中血糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和游离脂肪酸(NEFA)的影响，证明其降血糖、降血脂的药理活性。 然后将苦丁茶水煎液提取物按照化合物极性分为3个不同部位（部位A：100%甲醇回流部位、B：50%甲醇回流部位、C：50%甲醇回流残渣部位），并对这3个部位同时进行降血糖、降血脂的药理活性比较，采用单次高剂量腹腔注射四氧嘧啶(200mg·kg-1)的方法建立一型高血糖模型小鼠模型。以苦丁茶水煎液不同部位相当于苦丁茶原药材15g·kg-1·d-1的剂量灌胃治疗1个月，观察苦丁茶水煎液三个部位对高血糖模型小鼠体重的影响以及对小鼠血清中各项生化指标的影响。研究苦丁茶水煎液的不同部位对一型高血糖模型小鼠体重的影响以及对一型高血糖模型小鼠血清中GLU、TC、TG、SOD、MDA和NEFA的影响，筛选苦丁茶的降血糖、降血脂的活性部位。 最后，对活性部位进行系统的研究，包括苦丁茶活性部位的动物药理实验、降血糖和降血脂的作用机理、活性部位的化学成分研究。采用高脂饲料配合低剂量两次注射四氧嘧啶(60mg·kg-1)的方法建立二型糖尿病小鼠模型。以苦丁茶活性部位A的高、中、低三个剂量组(1.27、2.54、3.81g部位A·kg-1·d-1，相当于苦丁茶生药材5、10、15g·kg-1·d-1)灌胃治疗四周，观察苦丁茶活性部位A的高、中、低三个剂量组对二型糖尿病小鼠体重、进食量、进水量、及血清中GLU、TC、TG、SOD、MDA和NEFA水平的影响。同时，利用高分辨率飞行时间液相串联层析质谱技术(HR-Q/TOF-LC-MS/MS)对苦丁茶降血糖活性部位的化学成分进行系统的研究；然后，以分子生物学理论为指导，采用实时定量RT-PCR的方法研究实验小鼠肝脏中与糖代谢、脂代谢相关的基因:羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（Hmgcr）基因，脂肪酸合成酶（Fas）基因，葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）基因，葡萄糖激酶（Gck）基因的表达情况，初步阐述苦丁茶活性部位调节糖脂代谢紊乱的作用机理。 实验结果表明，（1）苦丁茶水煎液能够显著降低二型糖尿病小鼠血清中的GLU、NEFA、TC、TG和MDA水平(p＜0.05)，显著提升二型糖尿病小鼠血清中SOD值(p＜0.05)，验证了苦丁茶水煎液对二型糖尿病小鼠良好的治疗作用。（2）通过不同部位的降血糖药理实验比较发现，苦丁茶水煎液部位A能够显著降低一型高血糖模型小鼠血清的GLU，TC水平(p＜0.05)，显著升高一型高血糖模型小鼠血清的SOD水平(p＜0.05)，部位B和部位C没有显著的降糖活性，说明苦丁茶的降血糖活性成分主要存在于部位A中。（3）苦丁茶活性部位A的高、中、低三个剂量组能够显著降低二型糖尿病小鼠体重、进食量、进水量、及血清中GLU(p＜0.05)水平，其中高剂量组能够显著降低二型糖尿病小鼠血清TC、TG和NEFA水平(p＜0.05)，显著提高血清SOD活性(p＜0.05)，能缓解糖尿病中“三多一少”的典型症状。（4）通过实时定量RT-PCR技术对苦丁茶中糖脂代谢相关基因表达的研究发现，苦丁茶活性部位A能够显著上调二型糖尿病小鼠肝脏中Hmgcr和Gck基因的表达；显著下调二型糖尿病小鼠肝脏中Fas和G6pc基因的表达。初步阐明了苦丁茶活性部位A降血糖、降血脂的作用机理可能包括：通过上调Hmgcr基因表达，诱导肝脏中胆固醇的合成和摄取，进一步通过胆汁酸排泄，并下调Fas基因表达，来改善糖尿病小鼠的脂代谢紊乱；同时，通过下调G6pc基因表达，减少糖异生，上调Gck基因表达而加速糖代谢从而降低体内葡萄糖的水平。（5）通过LC-MS/MS技术对苦丁茶活性部位A化学成分的研究，共检测到苦丁茶部位A中的17个主要化合物，鉴定了其中16个成分，包括3个绿原酸异构体（新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸）、3个二咖啡酰基奎宁酸异构体、4个黄酮以及6三萜皂苷类成分。 课题研究以传统中医药理论为指导，以苦丁茶水煎液为初始研究对象，更符合苦丁茶的临床应用经验。同时将现代先进的LC-MS/MS技术成功应用于中药苦丁茶调节糖脂代谢的物质基础研究，鉴定了苦丁茶活性部位中的主要活性成分，表明了苦丁茶调节糖脂代谢紊乱的物质基础。然后以实时定量RT-PCR技术初步阐明了苦丁茶调节糖脂代谢的作用机理。本课题的研究成果为苦丁茶的开发利用奠定了坚实的基础。