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鄂西北白及产地适宜性与品质评价研究

陈黎  
【摘要】:目的 考察白及野生资源分布区域及产地生态适宜性,探讨白及组织培养的条件和方法、对白及质量评价方法进行研究,为鄂西北地区白及的规模化种植、资源开发与利用提供参考依据。 方法 1.白及的品种整理与鉴别研究 1.1白及产地适宜性分析 在对中国植物数字标本馆(CVH)收载的近600份白及与近缘物种小白及、黄花白及、华白及的标本数据进行整理、分析的基础上,利用中药材产地适宜性分析地理信息系统(TCMGIS)技术,对适宜白及生长的环境及其影响因子进行分析,得出相似度在95~100%的适宜白及规模化种植生长环境因素。 1.2白及的DNA条形码鉴别研究 提取白及药材及射干、黄精、玉竹、知母等混伪品共8个物种39余份样品DNA, PCR扩增其ITS2序列并双向测序,应用CodonCode Alignerv4.25对测序峰图进行校对拼接,并去除低质量序列及引物区,得到ITS2序列。用MEGA6.0软件计算物种种内和种间Kimura2-parameter(K2P)遗传距离,分析变异位点并构建NJ系统发育树,综合应用相似性搜索法、最近距离法以及NJ系统发育树等进行鉴定分析。 1.3鄂西北白及品种鉴别研究 建立白及与黄花白及的药材性状、显微、理化、TLC等特征鉴别方法。对白及与黄花白及根茎横切面进行显微鉴定、理化鉴定、薄层色谱鉴别研究。 2.白及组织培养技术研究 考察不同激素浓度和配比对白及不同外植体诱导分化、增殖及生根的影响。通过对白及外植体诱导苗的分化、丛生芽的增殖以及生根培养,建立了白及组培快繁体系;研究白及组培扩繁的方法,探讨白及组培最佳部位与最佳培养基配比。 3.鄂西北白及的品质评价研究 3.1白及的质量评价研究 探讨蒽酮-硫酸法测定多糖含量的影响因素,优选白及多糖含量测定的最优条件。对鄂西北地区不同产地的白及中所含的白及多糖含量进行测定,采用水提醇沉法提取白及多糖,以蒽酮-硫酸试剂为显色剂,采用紫外分光光度法测定多糖含量。测定鄂西北地区白及块茎中总酚的含量,以没食子酸为对照品,采用Folin-酚比色法,运用可见-紫外分光光度法测定不同产地白及块茎中总酚的含量,并进行了水分、灰分、重金属的测定。采用HPLC法,建立测定不同产地白及药材中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量的HPLC方法,对其含量采用均数法进行聚类分析。通过对鄂西北地区19批次的白及进行梯度洗脱,建立鄂西北地区白及化学成分的HPLC指纹特征图谱。 3.2白及主要成分研究 采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)萃取白及中挥发性成分,并用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对白及的挥发性成分进行分析。 采用AB Sciex4000Q-TRAP型质谱仪多重反应监测(M R M)扫描模式对白及对照药材和白及样品分别进行检测。测定白及中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯、原儿茶酸和咖啡酸的含量,建立了基于Q-TRAP LC-MS的白及活性成分的检测方法。 4.白及药理作用研究 分别对白及乙酸乙酯、正丁醇及水部位进行出、凝血时间测定,初步筛选出白及止血、活血部位;再通过大鼠血瘀模型和小鼠胃溃疡模型,进一步论证EtOAc部位对血瘀模型大鼠血液流变学各项指标的影响以及n-BuOH部位对小鼠胃溃疡模型的影响,探讨白及不同提取部位对血液流变学的影响与药理活性。 结果 1.白及品种整理与鉴别研究 1.1白及产地适宜性分析 通过对中国数字植物标本馆白及项下的近600份白及及其近缘种小白及、黄花白及、华白及的标本进行数据的录入,内容包括标本馆名称、条形码、采集人、采集时间、采集地、坐标、鉴定人、鉴定时间、鉴定结果等内容,通过对白及的采集地点进行整理、汇总、分析,基于“中药材产地适宜性分析地理信息系统”(TCMGIS)中基础地理信息数据库、气候因子数据库、土壤数据库和中药材分布空间数据库四个数据库中的图表索引和空间分析功能,提取白及标本点处的上述数据库中的气候数据和土壤数据,然后对数据进行系统分析,得出适宜白及规模化种植生长环境因素,对白及的规模化种植提供科学依据。 1.2白及的DNA条形码鉴别研究 白及的最大种内K2P遗传距离为0.035,远小于其与混伪品的种间最小遗传距离为0.31;NJ树结果显示,14条白及序列单独聚为一枝,且与混伪品可明显区分。以上鉴定方法分析结果表明,ITS2序列能将白及药材与混伪品鉴别开 1.3鄂西北白及品种鉴别研究 通过对白及根茎横切面进行显微鉴定、理化鉴定、薄层色谱鉴别,鄂西北地区的白及经鉴定主要为兰科白及属植物白及Bletilla striata、黄花白及Bletilla ochracea两个来源,白及与黄花白及薄层色谱鉴别,无明显区别。 2.白及幼根组织培养技术研究 通过研究不同浓度激素和不同激素配比对白及不同外植体诱导分化、增殖及生根的影响。结果表明,幼根最容易诱导出丛生芽,其最佳培养基为1/2MS+1.0mg/L6-BA+2.0mg/L NAA;丛生芽增殖最佳培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA;生根培养基以1/2MS+0.5mg/L NAA为最佳。白及叶片丛生芽在本实验中没有诱导出来,鳞茎丛生芽诱导率也比较低且后期生长缓慢。 3.鄂西北白及的品质评价研究 3.1白及多糖的含量测定研究 在单因素试验的基础上,采用L9(34)正交试验,以加热时间、加热温度、蒽酮-硫酸试液的用量作为考察因素,以吸光度值为评价指标,优选蒽酮-硫酸法测定白及多糖含量的最佳条件。最佳测定条件是蒽酮-硫酸试液用量为4.5mL,加热温度为100℃,加热时间为3min,显色剂浓度0.2%,测定波长625nm。精制白及多糖换算因子f为1.69。 对鄂西北地区不同产地的白及多糖含量进行测定,采用水提醇沉法提取白及多糖,以蒽酮-硫酸试剂为显色剂,采用紫外分光光度法测定多糖含量。测定结果显示,鄂西北地区不同产地的白及药材中多糖的含量相差较大。 3.2白及总酚的含量测定研究 以没食子酸为对照品,采用Folin-酚比色法,运用可见-紫外分光光度法测定不同产地白及块茎中总酚的含量。不同产地的白及药材中总酚含量差异较大,说明生长环境对白及总酚含量有明显影响。 3.3白及中苹果酸酯的含量测定研究 采用HPLC法,测定不同产地的白及药材,1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量差别明显,对其含量采用均数法进行聚类分析,结果显示,1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量高低有明显的地域性。 3.4白及水分、灰分、重金属测定 对不同产地的白及进行水分、灰分检测,结果表明,不同产地的白及样品中总灰分、水分均未超标,不同产地白及之间的总灰分含量有一定的差异。 针对不同产地白及中的铅、镉、铜等重金属,通过原子吸收光谱法(AAS)进行测定,结果表明,鄂西北不同产地的白及样品中重金属铅、镉、铜的含量,仅有个别品种铜的含量超标,其余均在合格范围内。 3.5白及指纹图谱研究 建立鄂西北地区白及化学成分的HPLC指纹特征图谱。用乙腈和水为流动相,进行梯度洗脱,不同产地的15批白及药材化学成分特征图谱共检出9个分离度良好的共有峰。通过聚类分析,白及药材产地与特征图谱相似度差异不大。 3.6白及主要化学成分研究 采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)萃取白及中挥发性成分,并用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对白及的挥发性成分进行分析,从白及中共分离出27个色谱峰,经化学工作站数据处理系统及用面积归一化法从其总离子流图中计算了各组分的百分含量,按各峰的质谱图经计算机质谱数据库检索,鉴定出其中11种化合物,占总量的91.25%。其中主要成分为对甲酚(47.22%)、已醛(43.33%)等。 测定白及中活性成分1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯、原儿茶酸和咖啡酸的含量,建立了基于Q-TRAP LC-MS/MS的检测方法。采用AB Sciex4000Q-TRAP型质谱仪多重反应监测(M R M)扫描模式对白及对照药材和白及样品分别进行检测。白及中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯、原儿茶酸和咖啡酸的含量分别为0.7088mg/g、0.0011mg/g和0.0004mg/g。 4.白及药理作用研究 通过对白及乙酸乙酯、正丁醇及水部位不同提取部位进行出、凝血时间测定,结果表明,EtOAc部位具有活血作用,n-BuOH及水部位具有止血作用;EtOAc部位高、中、低剂量均可显著地降低血瘀模型大鼠的血液流变学各项指标,n-BuOH部位有显著改善胃溃疡的作用。 结论 1.通过对白及样本的分析,提取了适宜白及生长的温度、气候、土壤条件,鄂西北地区在白及产地适宜性相似度100%的区域内,适宜白及的规模化种植。 2.ITS2序列能准确鉴别白及药材与混伪品,为避免白及药材混用及保障临床安全用药提供了新的技术手段。 3.通过研究不同激素浓度和配比对白及不同外植体诱导分化、增殖及生根的影响,建立了白及幼根组织培养体系。 4.对鄂西北地区不同产地的白及中多糖、多酚、1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量进行测定,建立了白及药材多指标成分质量控制体系,为保证白及的质量提供了依据。 5.建立了白及的指纹图谱质量评价体系,可以全面评价白及的质量。 6.采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对白及的挥发性成分进行分析,并采用液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术对白及中主要化学成分进行了分析,全面而客观的分析了白及的化学成分。 7.通过对白及不同提取部位的药理活性研究,白及乙酸乙酯部位具有活血作用,白及正丁醇部位可以显著改善出血症状。


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