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慢性肾小球肾炎病证结合唾液蛋白质组学研究

袁媛  
【摘要】:目的应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDITOF-MS)技术,选择西医确诊慢性肾小球肾炎(CGN)患者,根据病证结合分组,并与体检正常的健康人群对照,进行唾液蛋白质组学研究,初步建立慢性肾小球肾炎肾虚证的诊断模型;并从蛋白质组水平初步探讨中医同病异证的现代科学基础;建立具有中医特色无创伤的唾液蛋白质组诊断技术,进一步推动微观辨证学的发展和促进中医诊断学的现代化。方法采集88例唾液标本,其中正常对照者45例均为健康体检正常者。所有疾病患者均经过肾活检病理检查明确诊断。按病证结合分为以下两大组:(1)慢性肾小球肾炎与正常组:比较慢性肾小球肾炎患者与正常对照者蛋白质表达谱的差异。(2)中医同病异证分组:即以证候为纲进行分组,全部病例按中医虚证辨证标准分为脾虚、肾虚、脾肾两虚和非脾肾虚4组,与正常组对照进行研究。采用液态芯片(WCX磁珠)制备唾液样品,结合MALDI-TOF-MS质谱仪对所有慢性肾小球肾炎患者和正常对照组的唾液进行蛋白质的质谱检测。设定所有唾液样本检测的蛋白质采集分子量相对范围为2000~25000Da,对每个组合内的相同质荷比不同含量的蛋白进行分析比较,找到组合内蛋白含量有显著差异的质荷比峰。所得到蛋白质的质荷比峰值用Biomarker Wizard3.0软件过滤噪音,将软件处理后的蛋白质质谱峰强度值资料导入Biomarker Pattern Software5.0.2,采用决策树算法,确定最佳的筛选模型。选出组合内含量有显著差异(P0.05)的蛋白质波峰初步建立相应疾病、证候及病证结合的唾液蛋白质组诊断模型。将全部标本用随机数字表法分为学习训练组和验证组,用所建立的诊断模型分别在学习模式和测试模式下对样本进行分类诊断,对测试组标本在测试模式下进行双盲检测,验证和评估所建立诊断模型的敏感性、特异性和准确性,综合评价其诊断效率。结果(1)按西医疾病分组:正常对照组与慢性肾小球肾炎组两组样本共88例,对所有的样本检测质谱图进行分析比较,两个组共得到蛋白质峰为410个,其中224个统计差异显著的蛋白峰(P0.05),选择质荷比(m/z)为7101.90Da和2616.91Da两个蛋白质峰进行建模,识别率为93.02%,预测能力91.11%。临床回代检验结果,43例慢性肾小球肾炎患者中有35例被准确检出为慢性肾小球肾炎,45例正常组中有36例被准确检出为非慢性肾小球肾炎。结果表明,该诊断模型的准确率为80.68%(71/88),灵敏度为81.40%(35/43),特异度为80.00%(36/45)。(2)按中医同病异证分组:将慢性肾小球肾炎患者按照中医虚证诊断标准分为脾虚、肾虚、脾肾两虚3组,和45例正常对照组共81例。①虚证组与正常组对比:1)将脾虚组和正常对照组的唾液样本检测质谱图进行分析比较,得到具有统计差异的蛋白质峰共155个,通过遗传算法找到3个差异显著的蛋白峰,质荷比(m/z)分别为:7101.905Da、3641.061Da、3931.962Da;2)分析比较肾虚组和正常对照组的唾液样本检测质谱图,共得到227个具有统计差异的蛋白质峰。通过遗传算法找到肾虚患者有3个蛋白质峰,质荷比(m/z)分别为:2431.669Da、4660.730Da、7101.905Da显著高于正常人,建立诊断模型,识别率为90.00%,预测能力97.78%。临床回代检验结果,21例慢性肾小球肾炎肾虚证患者中有18例被准确检出为肾虚证,45例正常组中有42例被准确检出为非肾虚证。该诊断模型的准确率为90.91%(60/66),灵敏度为85.71%(18/21),特异度为93.33%(42/45);3)分析对比脾肾两虚组和正常对照组的唾液样本检测质谱图,共得到具有统计差异的蛋白质峰103个,通过遗传算法找到2个差异显著的蛋白峰,质荷比(m/z)分别为:7101.905Da、2616.913Da。②虚证组组间对比:1)对脾虚组和肾虚组样本检测质谱图进行分析比较,共得到具有统计差异的蛋白质峰35个,通过遗传算法找到1个差异显著的蛋白峰,质荷比(m/z):2952.974Da;2)对脾虚组和脾肾两虚组样本检测质谱图进行分析比较,共得到具有统计差异的蛋白质峰32个,通过遗传算法找到1个差异显著的蛋白峰,质荷比(m/z):2102.998Da;3)对肾虚组和脾肾两虚组样本检测质谱图进行分析比较,共得到具有统计差异的蛋白质峰12个,通过遗传算法找到1个差异显著的蛋白峰,质荷比(m/z):3872.561Da。结论本研究运用液态芯片结合MALDI-TOF-MS技术对慢性肾小球肾炎患者与正常对照组的睡液蛋白质进行表达谱检测,从唾液蛋白质组初步筛选出可用于慢性肾小球肾炎病证结合诊断的具有特异性的生物标记物,探索并建立了相关病证结合的诊断模型。该方法与传统的疾病生物标志物相关的检测方法相比较,具有无创伤性、操作简便、快捷、敏感性及特异性高等特点,其筛选出的生物标志物对于准确快速地疾病诊断、证候鉴别、预后判断均具有重要的临床意义。因此,本研究为慢性肾小球肾炎的早期诊断及证候鉴别开辟了新的途径,同时为中医微观辨证学的研究和发展开启了新的思路和研究领域。


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