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板党多糖对溃疡性结肠炎大鼠的防治作用及机制研究

赵晓芳  
【摘要】:目的:用三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠诱导大鼠溃疡性结肠炎疾病模型,和脂多糖(LPS)诱导小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)炎症模型,给予适量板党多糖,观察大鼠全身及局部状况和RAW264.7细胞的变化,探讨板党多糖的防治作用及其机理,为后续研究提供理论和实验依据。1、板党多糖防治大鼠溃疡性结肠炎的作用方法:SD大鼠60只,随机分为6组,每组10只,分别为正常组、模型组、板党多糖低、中、高(0.25,0.50,1.00 g/kg)剂量组、固肠止泻丸组(1.08 g/kg)。各组按相应剂量灌胃给药5天后,以TNBS 60 mg/kg灌肠造模,每天1次连续灌胃给药3周。造模后第1,2,3及21天进行疾病活动指数(DAI)评价,末次给药30 min后乙醚麻醉,断头处死大鼠。取大鼠的结肠组织先进行黏膜损伤指数评价(CMDI)后,取一半组织进行HE染色,光学显微镜下观察组织形态结构进行组织病理学检查并评分,另一半-80℃保存,用作实时荧光定量PCR样本。结果:与正常组比,模型组大鼠见溃疡肉芽肿,病灶肠壁变厚,大部分大鼠有肠粘连,炎性细胞浸润情况严重,CMDI评价及病理学组织评分升高,具有显著性(P0.01、P0.01);与模型组比较,板党多糖组大鼠结肠充血水肿、溃疡症状减轻,组织病理学检查结果显示板党多糖组炎性细胞浸润情况明显改善,CMDI评价及病理学组织评分明显降低(P0.01、P0.01)。2、板党多糖防治大鼠溃疡性结肠炎的作用机制研究方法:分组及给药方法同第一部分。末次给药30 min后乙醚麻醉,断头处死大鼠。留取血清,检测血清中SOD、MDA及GSH-Px活力,取大鼠的另一半结肠组织,实时荧光定量PCR法检测其中TLR4,IL-6,NF-κB,TNF-α及IL-10的m RNA的表达。结果:与模型组比较,组织内MDA含量降低明显(P0.01),SOD及GSH-Px活力升高(P0.01、P0.01),具有显著性差异;对TLR4,IL-6,NF-κB,TNF-αm RNA表达具有下调作用(P0.01、P0.01、P0.01、P0.01),对IL-10 m RNA表达具有上调作用(P0.05)。3、板党多糖对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应的影响方法:首先利用MTT法确定不同浓度板党多糖、LPS及板党多糖+LPS对RAW 264.7细胞毒性的影响。然后考察细胞培养基中NO的含量,确定LPS合适的诱导细胞时间及浓度,并建立体外炎症模型,研究不同浓度的板党多糖(0.4、4、40μg/m L)对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应的影响。硝酸还原法考察细胞培养基中NO的含量,来评价板党多糖的抗炎作用,并采用实时荧光定量PCR检测细胞中TLR4,IL-6,NF-κB,TNF-α的m RNA的表达。结果:板党多糖在0.4~4000μg/m L浓度范围72h内,对RAW264.7细胞无细胞毒作用;LPS在0.1~10μg/m L浓度范围48h内,对RAW264.7细胞无细胞毒作用;确定以1μg/m L LPS诱导RAW 264.7细胞作用24 h产生炎症,建立体外炎症模型。与正常对照组比,板党多糖对RAW264.7细胞单独作用24h后,给药组培养基中NO的含量差异无显著性(P0.05);1μg/m L LPS诱导并给药24h后,与正常对照组比,LPS组细胞释放NO的量显著增高(P0.01),IL-6、TNF-α、NF-κB、TLR4的表达量明显升高,差异显著(均为P0.01),与LPS组比,给药组培养基中释放的NO含量明显降低(P0.01),基因的表达水平均显著下调(均为P0.01)。结论:1、板党多糖对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎具有显著的缓解、拮抗作用,并能明显改善UC对结肠黏膜造成的损伤。2、板党多糖对UC的治疗作用机制可能是通过激活TLR4-NF-κB路径来调节细胞炎症因子(IL-6、TNF-α及IL-10)及炎性介质(NO)的分泌,同时与抗氧化及抗炎作用有关。


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