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基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨蠲痛饮对子宫内膜异位症模型大鼠影响及作用机制研究

张亚萍  
【摘要】:目的:通过对中药水煎剂蠲痛饮与PI3K通路抑制剂LY294002干预子宫内膜异位症模型大鼠的对比,探讨蠲痛饮干预PI3K/Akt/mTOR通路对子宫内膜异位症发生发展的作用机制,以期为中医药防治子宫内膜异位症提供新思路,为现代科学理论阐明中医药作用机理提供一个良好的切入点。方法:本课题以SD大鼠为研究对象,通过自体子宫内膜移植方法建立子宫内膜异位症大鼠模型,观察不同剂量蠲痛饮水煎剂对模型大鼠的影响。1大鼠造模选择有正常动情周期的雌性大鼠为研究对象,按体重随机分为6个组,每组8只,分别为正常假手术组、模型对照组、蠲痛饮高剂量组、蠲痛饮中剂量组、蠲痛饮低剂量组和西药(LY294002)组。除正常组行开腹假手术外,其余各组均复制成子宫内膜异位症模型,造模术后4周开腹探查并取异位组织行病理学检查,证实造模成功。2分组给药正常组:术后4周起按照1ml/100g给予生理盐水大鼠灌胃,1次/d,给药4周;模型组:术后4周起按照1ml/100g给予生理盐水大鼠灌胃,1次/d,给药4周;蠲痛饮高、中、低剂量组在术后4周起按照成人临床用药量等效量的4、2、1倍分别给予42.9g、14.3g、4.8g/kg灌胃,给药4周;西药组:造模后5周开始以LY294002溶于DMSO后腹腔注射,以0.04g/kg进行计算,每周腹腔注射一次,给药4周。3指标检测分组灌胃给药4周后,禁食12小时,经乙醚麻醉,腹主动脉采血后处死。观察和测量大鼠异位病灶的组织形态及体积大小,剖取大鼠在位及异位子宫内膜组织分别置于液氮、4%多聚甲醛、电镜固定液中备用。应用透射电镜、elisa、免疫组织化学及real-timepcr法等现代分子生物学技术检测大鼠血清中il-1β、tnf-α、vegf、mmp-2的含量及在位内膜和异位内膜组织中pi3k、akt、mtor蛋白的表达及p70s6kmrna的相对含量。结果:1各组大鼠一般情况观察造模术后前三日,大鼠给予青霉素肌注预防感染,活动量减弱,部分大鼠毛发杂乱无光泽,伤口处偏湿润,给予局部碘伏消毒处理;造模术后4-9日,大鼠给予补佳乐水溶液(戊酸雌二醇)灌胃,部分出现腹胀、摄食量减少、排泄物以水质居多;造模术后10日至术后四周,大鼠给予正常喂养,体重增加明显,少数大鼠出现腹部伤口开线裂开,根据实际情况予以消毒或重新缝合处理。正常组假手术组大鼠毛发光洁整齐,眼睛有神,饲养期间无明显不良反应,其他模型组大鼠毛发脏乱,部分行动减慢,神态倦怠,双目无神,间断有摄食量下降的情况。其中,蠲痛饮高剂量组因为中药灌胃呛入气管致死1只。2各组大鼠子宫异位内膜光镜及透射电镜观察各组用药4周后异位内膜组织光镜下病理学图片如附录中实验性图片2.5所示,正常组子宫内膜腺体细胞排列整齐,腺体及间质细胞生长良好;模型组及蠲痛饮低剂量组腺体数目明显增多,大部分上皮细胞可见核下空泡,间质细胞较密集,有明显的新生血管生成,蠲痛饮高剂量组及西药组异位内膜腺体数目减少,间质细胞减少,或可见纤维化。各组大鼠子宫异位内膜透射电镜图像如附录中实验性图片2.1所示,正常组细胞内细胞器正常;模型组腺上皮细胞排列相对整齐,具备微绒毛,细胞胞浆形态基本正常;蠲痛饮高剂量组和西药组观察腺上皮细胞萎缩或欠整齐,微绒毛减少或消失,细胞胞核固缩,线粒体可见减少,并且有凋亡的间质细胞;蠲痛饮低剂量组腺上皮细胞排列不规则,微绒毛减少,胞浆中可见线粒体肿胀。3各组大鼠血清tnf-a、mmp-2、vegf、il-1β含量比较检测结果显示,与正常组大鼠相比,模型组和蠲痛饮低剂量组的血清tnf-a、mmp-2、vegf、il-1β含量均有显著升高,与其有显著性差异,具有统计学意义(p0.05),而与蠲痛饮中、高剂量及西药组相比无明显差异(p0.05);与模型组对比,中、高剂量、西药组干预后的血清tnf-a、mmp-2、vegf、il-1β含量具有显著差异(p0.05),但与低剂量组相比无显著性差异(p0.05);蠲痛饮中、高剂量组及西药组与蠲痛饮低剂量组相比,效果有显著差异(p0.05),但中、高剂量组及西药组之间效果无明显差异(p0.05)。4各组大鼠内膜组织pi3k、akt、mtor蛋白含量的表达与正常组对比,模型组及低剂量组中pi3k、akt、mtor蛋白含量明显升高,与其有显著性差异,具有统计学意义(p0.05),而与中、高剂量、西药组相比,无明显差异(p0.05);与模型组对比,中、高剂量、西药组干预后的表达具有显著差异(p0.05),但低剂量组与模型组无显著性差异(p0.05);蠲痛饮中、高剂量组及西药组与蠲痛饮低剂量组相比,效果有显著差异(p0.05),但中、高剂量组及西药组之间效果无明显差异(p0.05)。5各组大鼠内膜组织p70s6kmrna结果分析采用real-timepcr技术检测正常组大鼠子宫内膜及模型大鼠异位内膜组织的p70s6kmrna的表达。p70s6kmrna含量的表达通过计算标本的p70s6kmrna与β-actinmrna的对比进行测定。结果显示:与正常组对比,p70s6kmrna在各组模型大鼠的相对表达都明显升高,尤其与模型组及低剂量组相比,有显著性差异,具有统计学意义(p0.05),与、高剂量、西药组干预后效果无明显差异(p0.05);与模型组对比,中、高剂量、西药组干预后的表达具有显著差异(p0.05),但低剂量组与模型组无显著性差异(p0.05);蠲痛饮中、高剂量组及西药组与蠲痛饮低剂量组相比,效果有显著差异(p0.05),但中、高剂量组及西药组之间效果无明显差异(p0.05)。结论:1蠲痛饮具有良好的活血祛瘀止痛,温肾健脾利湿之功,对子宫内膜异位症有着确切的疗效;2蠲痛饮可以降低模型大鼠血清中TNF-a、MMP-2、VEGF和IL-1β的含量;3蠲痛饮可以降低模型大鼠异位内膜组织中PI3K、AKT、mTOR的蛋白含量的表达及p70s6k mRNA的水平;4蠲痛饮可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活来发挥对子宫内膜异位症模型大鼠的治疗作用。


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