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“标本配穴”预针刺调控肠道菌群-LPS-神经炎性反应对衰老模型大鼠学习记忆认知功能障碍的机制研究

何川  
【摘要】:目的肠道菌群可以通过肠-脑轴影响认知功能。在衰老的过程中,肠道菌群失调会产生大量具有促炎性的神经毒性物质脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)。肠道中的LPS会透过生理屏障进入大脑,诱发神经炎症反应,最终导致认知功能障碍。因此在衰老的过程中积极采取措施调控肠道菌群,或许是缓解神经炎症及认知功能障碍的关键。所以,本实验以D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠为研究对象,从肠道菌群代谢产物LPS与神经炎症的关系出发,探究预电针对衰老模型大鼠目标肠道菌群的调节,对肠粘膜屏障及血脑屏障的调控,以及对系统性炎症及神经炎症的影响,进一步阐明预电针通过调节肠道菌群防治衰老相关认知功能障碍的可能机制。方法3月龄Sprague Dawley雄性大鼠60只,随机分为正常组、模型组、百会组、足三里组、百会+足三里组,每组12只。各组大鼠饲养环境相同,除正常组外,其余各组予D-半乳糖(120mg/kg/天)连续腹腔注射8周。百会组、足三里组、百会+足三里组大鼠自造模第一日起分别予电针百会、足三里、百会和足三里干预。百会穴向前平刺3-5mm,足三里穴直刺4-6mm,接上HANS-200A型电针治疗仪。电针治疗参数:频率50Hz,电流1m A,时间20min,每日1次,共治疗8周。正常组、模型组在其他组干预时进行相同的抓取捆绑固定。各组大鼠干预结束后进行开放旷场实验、Morris水迷宫实验等行为学检测。随后进行血清取材、新鲜海马组织、肠粘膜组织取材和灌注取材并进行指标检测。应用透射电镜观察海马CA1区突触后致密带厚度和突触间隙宽度以及小胶质细胞形态变化;应用RT-PCR检测目标肠道菌群的变化;应用HE染色观察结肠粘膜形态变化;应用Western-Blot法检测结肠组织ZO-1蛋白表达水平,海马组织ZO-1、LPS、TLR4、P-NF-κB p65、TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表达水平;应用ELISA法检测血清DAO、S100β、LPS、TNF-α、IL-1β的含量;应用免疫荧光检测海马CA1区Iba-1的表达。结果1.预电针能够改善D-半乳糖诱导衰老模型大鼠的认知损伤,且―标本配穴‖预电针的保护效应强于单穴。(1)旷场实验结果:与正常组比较,模型组大鼠的运动距离、直立次数和中央区域停留时间明显下降(P0.01);与模型组相比,预电针组大鼠的运动距离、直立次数和中央区域停留时间均显著升高(P0.01),说明预电针能够改善衰老大鼠的抑郁情绪。另外,与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠的运动距离、直立次数和中央区域停留时间均明显降低(P0.01),说明―标本配穴‖在改善衰老模型大鼠抑郁情绪方面更佳。(2)Morris水迷宫实验结果:与正常组相比,模型组大鼠的逃避潜伏期显著延长(P0.01);与模型组比较,预电针组逃避潜伏期显著减短(P0.01)。与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠逃避潜伏期明显延长(P0.05,P0.01)。空间探索实验中,与正常组相比,模型组在原平台象限探索时间显著降低(P0.01);与模型组比较,预电针组大鼠在原平台象限的探索时间均显著延长(P0.01);与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠在原平台象限的探索时间明显缩短(P0.05),―标本配穴‖预电针在改善衰老模型大鼠学习记忆方面优于单穴。2.预电针能够改善D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠海马CA1区的突触损伤和抑制小胶质细胞激活,且―标本配穴‖的保护效应强于单穴。(1)突触后致密带厚度和突触间隙结果:各组大鼠海马CA1区的突触间隙宽度均无统计学差异变化。而在影响突触后致密带厚度方面,与正常组相比,模型组大鼠海马CA1区的突触后致密带厚度显著减小(P0.01);与模型组相比,预电针干预能够提高突触后致密带厚度(P0.01);与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠海马CA1区的突触后致密带厚度明显减小(P0.01)。(2)小胶质细胞形态变化结果:正常组大鼠小胶质细胞,胞体较小,胞质胞核界限清晰,未见明显溶酶体。模型组大鼠胞体呈现阿米巴形态,细胞器溶解,细胞核膜肿胀溶解,与胞质界限不清,并产生大量溶酶体,提示小胶质细胞被激活。电针干预后,溶酶体数量减少,细胞核膜清晰,与胞质界限清楚,未见明显阿米巴样变性。3.预电针能调节D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠肠道菌群结构,保护肠粘膜屏障功能,减少LPS进入血液,缓解系统性炎症,且―标本配穴‖的保护效应较之单穴佳。(1)目标肠道菌群RT-PCR结果:与正常组比较,模型组大鼠乳酸杆菌、双歧杆菌相对基因表达量显著降低,脆弱拟杆菌、大肠杆菌相对基因表达量显著增高(P0.01)。与模型组比较发现,预电针组大鼠乳酸杆菌、双歧杆菌相对基因表达量显著上升,脆弱拟杆菌、大肠杆菌相对基因表达量显著降低(P0.01)。与百会+足三里组相比,百会组、足三里组乳酸杆菌、双歧杆菌相对基因表达量明显下降,脆弱拟杆菌、大肠杆菌相对基因表达量明显上升(P0.01)。说明预电针能调节肠道菌群,促进益生菌生长,抑制致炎性菌。(2)结肠组织HE染色结果:正常对照组大鼠肠黏膜上皮细胞完整,腺体排列整齐紧密,富含杯状细胞,未见明显炎性细胞浸润,毛细血管未见充血、扩张。模型组大鼠肠黏膜糜烂,肠黏膜上皮细胞大量破坏缺如,腺体排列紊乱,可见炎性细胞浸润,毛细血管可见充血、扩张。各电针组大鼠肠黏膜上皮细胞较完整,腺体排列较整齐紧密,富含杯状细胞,固有层仅可见少量炎性细胞,毛细血管少量充血、扩张。(3)结肠组织ZO-1蛋白结果:与正常组比较,模型组大鼠结肠组织ZO-1蛋白相对表达量显著降低(P0.01)。与模型组比较发现,预电针组大鼠结肠组织ZO-1蛋白相对表达量显著升高(P0.01)。另外,与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠结肠组织ZO-1蛋白相对表达量明显降低(P0.01)。(4)血清DAO含量结果:与正常组比较,模型组大鼠血清DAO含量显著升高(P0.01);与模型组比较发现,电针组大鼠血清DAO含量显著降低(P0.01);与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠血清DAO含量明显升高(P0.05,P0.01)。说明电针能改善肠粘膜屏障功能,―标本配穴‖预电针比单纯使用百会或足三里能更有效地保护肠粘膜屏障。(5)血清LPS、TNF-α、IL-1β含量结果:与正常组比较,模型组大鼠血清LPS、TNF-α、IL-1β含量显著升高(P0.01);与模型组比较发现,电针组大鼠血清LPS、TNF-α、IL-1β含量显著降低(P0.01);说明预电针能减轻外周炎症反应。与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠血清LPS、TNF-α、IL-1β含量明显升高(P0.05,P0.01)。说明―标本配穴‖预电针比单纯使用百会或足三里能更有效地缓解外周炎症。4.预电针能保护D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠血脑屏障功能,减少外周血中LPS进入大脑,减少小胶质细胞的激活,通过抑制TLR4/NF-κB信号通路缓解神经炎症反应,且―标本配穴‖的保护效应较之单穴佳。(1)海马组织ZO-1蛋白表达结果:与正常组比较,模型组大鼠海马组织ZO-1蛋白相对表达量显著降低(P0.01);与模型组比较发现,电针组大鼠海马组织ZO-1蛋白相对表达量显著升高(P0.01);与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠海马组织ZO-1蛋白相对表达量明显降低(P0.01)。(2)血清S-100β含量结果:与正常组比较,模型组大鼠血清S100-β含量显著升高(P0.01);与模型组比较发现,电针组大鼠血清S100-β含量显著降低(P0.01),说明电针能缓解血脑屏障的损伤。与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠血清S100-β含量明显升高(P0.01),说明―标本配穴‖对血脑屏障的保护效应较之单穴佳。(3)海马组织LPS蛋白表达结果:与正常组比较,模型组大鼠海马组织LPS相对表达量显著升高(P0.01)。与模型组比较发现,电针组大鼠海马组织LPS相对表达量显著降低(P0.01)。另外,与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠海马组织LPS相对表达量明显升高(P0.01)。说明电针能减少LPS透过血脑屏障进入大脑,―标本配穴‖的保护效应更佳。(4)海马CA1区Iba-1荧光标记的激活的小胶质细胞及海马组织Iba-1蛋白表达比较:与正常组比较,模型组大鼠海马CA1区激活的小胶质细胞数量显著增多,海马组织Iba-1蛋白表达显著增加(P0.01)。表明连续D-半乳糖腹腔注射能诱发大鼠小胶质细胞的激活。与模型组比较发现,电针组海马CA1区激活的小胶质细胞数量显著减少,海马组织Iba-1蛋白表达显著降低(P0.01)。表明电针能减轻衰老大鼠海马CA1区激活的小胶质细胞数量。与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠海马CA1区激活的小胶质细胞量明显增多,海马组织Iba-1蛋白表达增多(P0.01),说明―标本配穴‖能更有效地减少小胶质细胞的激活。(5)海马组织TLR4/NF-κB相关蛋白结果:与正常组比较,模型组大鼠海马组织TLR4、p-NF-κB蛋白表达显著升高(P0.01)。与模型组比较,电针组大鼠海马组织TLR4、p-NF-κB蛋白表达显著减少(P0.01)。与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠海马组织TLR4、p-NF-κB蛋白表达明显升高(P0.01);与正常组比较,模型组大鼠海马组织TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达显著升高(P0.01)。与模型组比较,电针组大鼠海马组织TNF-α,IL-6及IL-1β蛋白表达显著减少(P0.01)。与百会+足三里组相比,百会组和足三里组大鼠海马组织TNF-α,IL-6及IL-1β蛋白表达明显升高(P0.05,P0.01)。说明电针能通过TLR4/NF-κB信号通路缓解神经炎症反应,且―标本配穴‖对保护效应较之单穴佳。结论1.预电针能够改善D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠的抑郁情绪和空间学习记忆能力,且―标本配穴‖的保护效应较之单穴佳。通过缓解突触功能障碍和神经炎症反应可能是预电针缓解衰老模型大鼠认知损伤的重要机制之一。2.预电针能调节D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠肠道菌群结构,保护肠粘膜屏障功能,减少LPS进入血液,缓解系统性炎症,且―标本配穴‖的保护效应较之单穴佳。3.预电针能保护D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠血脑屏障功能,减少外周血中LPS进入大脑,减少小胶质细胞的激活,从而缓解神经炎症反应,且―标本配穴‖的保护效应较之单穴佳。通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,减少下游炎症因子的合成及释放从而减轻神经炎症反应可能是预电针防治衰老模型大鼠认知损伤的重要机制之一。


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17 记者 赵姝婧;邵峰实验室发文发现细菌LPS合成的前体庚糖分子可被宿主新型免疫受体激酶ALPK1识别,进而激活宿主天然免疫反应[N];新清华;2018年
18 ;关木通对大鼠致癌性的实验研究[N];中国医药报;2003年
19 本报记者 甘贝贝;肠道菌群调控或是PCOS新疗法[N];健康报;2021年
20 记者 蓝建中;日本研究:骨髓移植使大鼠血管“返老还童”[N];新华每日电讯;2010年
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