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帕金森氏病Synphilin-1基因分析及针刺对Synphilin-1 mRNA表达的影响

李蕾  
【摘要】: 特发性帕金森氏病(PD)是一种缓慢进展的神经系统变性疾病,病理改变见于中脑黑质纹状体,神经细胞内存在嗜酸性包含体,又称Lewy氏小体。最新研究发现Synphilin-1是Lewy氏小体的组成成分并与a-Synuclein共同作用,促使Lewy氏小体的形成。 由于特发性帕金森氏病发病机制尚不清楚,迄今为止均系对症治疗。药物治疗虽能使患者的症状在一定时间内获得不同程度的好转,但不能阻止本病的自然进展;外科立体定向手术治疗不仅风险大且费用昂贵;脑移植存在着人体的排斥现象;基因转染技术的研究迄今为止只限于动物模型的开展。中医,针灸作为中国传统的治疗方法,在治疗脑血管病及神经系统方面由于疗效显著,备受国内外学者的青睐。随着分子生物学的进展,对PD病发病机制及针刺治疗作用机理的研究成为众多学者关注的焦点。 本课题运用现代分子生物学技术思路和方法,拟探讨Synphilin-1基因在帕金森氏病发病中的作用机制并检测针刺治疗前后外周血细胞内Synphilin-lmRNA的差异表达,研究PD神经变性的发病机制以及针刺治疗PD的基因调控机理,为帕金森氏病的基因诊断及针刺防治帕金森氏病提供更为科学的理论依据。 一、帕金森氏病Synphilin-1基因分析 本研究运用单链构象多态性-PCR技术(SSCP-PCR),对508例特发性帕金森氏病的DNA进行Synphilin-1基因全长10个片段(包括外显子、内显子)多态性的详尽分析,对筛选得到的阳性结果重新进行DNA的扩增和纯化并在自动测序仪上进行序列测定,分析该片段是否发生错译与突变。 508例病例中,女性患者184例,男性患者324例,年龄最小的为22岁,年龄最大的为84岁,有家族遗传史者64例。 该实验SSCP-PCR中的标记物为磷~(32)P,均在放射实验室中进行。研究显示:片段A阳性表达11例,片段B阳性表达6例,片段2阳性表达13例,片段3阳性表达7例,片段4阳性表达11例,片段5阳性表达6例,片段6阳性表达1例,片段7阳性表达9例,片段8阳性表达9例,片段9阳性表达3例。 对上述阳性结果进行的DNA序列测定显示:PA23DNA外显子3在729位点上发生序列改变C729T,PA54DNA外显子3在5057位点上也发生序列改变C5057T,同样的阳性结果在外显子8上也有一例发生碱基改变C1603T,但以上的序列改变并不发生氨基酸的错译,内显子A有4例发生同样的改变。 研究表明:Synphilin-1蛋白与帕金森氏病的发病有关,其DNA的结构在不同的PD个体中存在复杂的变构和多态性,在本研究人群中多态性见于DNA各个片段,DNA的碱基改变发生在少数个体中,但未见错译及突变,本研究表明Synphilin-1基因与PD的发病无关。 二、针刺治疗前后外周血细胞内Synphilin-lmRNA的表达 2.1 针刺治疗帕金森氏病的临床观察 特发性帕金森氏患者12名,针刺颞前线、风府、太冲,隔日一次,10次为1疗程。经针刺治疗后,患者震颤、肌强直、运动减少等体征均有不同程度的改善,部分患者记忆力,睡眠质量有所提高,出汗、恐惧等症状也有所减轻。临床观察表明:针刺可明显改善PD患者的临床症状,尤其以震颤型疗效最佳。实验对照组6名(经a-多巴胺治疗,患者 连续服用 a-多巴胺片 20大,5()omg/次,一大三次)。患者经a-多巳胺治疗后, 肌强直、运动减少等体征也有不同程度的改善,但其它症状的改善不如针刺治疗 组。 2.2 实验研究 用逆转录卜C以厂1”-1汇D方法分析针刺治疗PD病前后患者外 周血细胞 Syn-ph if in-lmRNA的蛋臼表达 针刺治疗组 12名,实验对照组 6名,治疗前清晨抽取患者外周静脉血 sinl,治 疗结束后立即抽取患者外周静脉血5ml(用抗凝管取血)。血细胞RNA模板的制 备方法用异硫氰酸肌和有机溶剂提取RN A,所用引物如下: 上游引物 5’-GAG CCT GAA AAC CAG AGT AAA G-3’ (位于3号内显于位置在基因序列841号。xon 3) 下游引物 5’-CTG AAG AAG CCA CAG AAG AAT C-3’ (位于6号内显了位置在基因序列1:395号。-con6) RI”-PCR实验方案; CDNA第1链的合成: 样品总 RNA SUI 10X逆转录酶缓冲液 ZXI AMW逆转录酶 卯UI RNSSifl 20口1 dN‘fPS Zul 上游引物 山UI 下游引物10UI 去离子水补至 以)UI 42oC反应 40Inin 95℃灭活逆转录酶10min RCR扩增:退火温度为55℃ 5%琼脂糖凝胶电泳,紫外《]f观祭结果并显影分析。 研究表明针刺治疗前后Synphilin-lmRNA 的表达有显著差异。 S叩phnhdm删A表达经针刺治疗后不同程度较前减少,实验对照组治疗前后的 表达无明显差异。本研究有迹象显示:针刺治疗帕金森氏病可能通过减少 SynphilindRNA表达而减少神经细胞的变性,同时提示针刺治疗帕金森氏病的 作用机制可能是通过基因的调控机制而发挥作用。


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