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针刺VD大鼠海马内新基因筛选、鉴定及其学习记忆相关基因的表达

张雪朝  
【摘要】: 血管性痴呆(Vascular Dementia,VD)是指各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合症,为一种慢性进行性疾病,患者有明显的记忆、计算、思维、定向、判断等能力障碍。随着世界人口老龄化,VD发病率与日俱增,它不仅严重影响老年人工作、生活质量,而且给社会和家庭带来沉重的经济和精神负担。VD已成为当今老年医学与精神医学领域中一个重要的研究热点。 国内外对VD的中、西医药治疗研究日渐增多,针刺治疗VD的临床报道也呈上升趋势,其良好的治疗效果提示针剌治疗VD有着很好的前景。近几年,大量临床实验和动物实验已证实针刺可使VD患者的智力明显提高,同时改善VD的其它症状,并发现治疗与基因表达有关,但其治疗机理尚不清楚,很少见到从分子水平研究其针刺治疗机理的报道,尤其未见用基因的差异显示等分子生物学技术对VD疾病相关基因以及针刺治疗VD的相关基因进行筛选。 为初步探索针刺对VD疾病基因的调控和功能修饰机制,特进行本实验的研究。实验选用老年健康SD大鼠,采用改良的4-血管阻断全脑缺血法(4-VO),建立近似人类学习记忆等智能障碍的血管性痴呆动物模型(Vascular Dementia Model,VDM)。根据中医学和针灸学的基础理论以及临床治疗报道,选取肾俞、百会、足三里三个穴,进行针刺治疗。为观察最佳治疗时间,治疗组大鼠被分为早期治疗和晚期治疗以及早期教长时间治疗三个组。治疗结束后,以行为学模式Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力的改善,以形态学Nissl染色检测学习记忆相关脑区海马神经元的病理学变化。然后,借助现代最新分子生物学技术:RNA指纹法,筛选VD以及针刺治疗的反应性基因,并克隆部分未知基因,试图了解VD发生和发展机制,以及针刺对VD疾病基因的调控和功能修饰机制。实验还利用R-—PCR、原位杂交、免疫组织化学等方法,观察针刺治疗后大鼠海马内与学习记忆密切相关的两个已知基因(BDNF、HO-1)的表达,从另一个角度了解针刺对VD疾病相关基因的调控。总之,本实验从整体、细胞、分子三个不同层次观察针刺治疗VD的效果,并进一步探讨VD发病机制及针刺治疗VD的分子机理。 实验结果如下: 1.成功复制VD大鼠模型 双侧椎动脉和颈总动脉成功阻断(4-VO)后,1-2分钟内大鼠EEC呈现一直线,翻正反射消失,虹膜呈现苍白色,再灌注后以上各指标逐渐恢复至正常,提示4-VO手术成功。行为学成绩和形态学变化是研究VD病理和治疗有效药物和方法筛选的两个基本指标,本实验借助此两指标检测 . 张雪朝博士学位论文 针刺VD大鼠海马内新基因筛选、鉴定 及其学习记忆相关基因的表达 中文摘要 出的一种保护性反应。(2)针刺治疗后大鼠海马内BDNF nRNA表达大量 增加,与此同时大鼠学习记忆能力明显改善,提示针刺肾、足三里、百 会等穴位改善VD学习记忆障碍可能是针刺改善了脑内神经元生存环境, 促进脑内细胞分泌BDNF,抑制神经元的凋亡,促进神经元再生、修复。 6.针刺治疗VD与海马内HO-1变化有关 利用原位杂交、免疫组化等技术,观察大鼠海马内HO-lmRNA和蛋 白表达的变化。实验结果发现,(1)VD组大鼠海马组织HO-lmRNA及免 疫阳性细胞表达较正常组明显增高,尤其在CA;、CA;区的锥体细胞层以 及齿状回变化最明显。结果提示,VD大鼠海马HO-lmRNA和蛋白表达量 增加可能是VD发生、发展的病理机制之一。(2)针刺1、2、3组大鼠海 马组织HO-lmRNA及免疫阳性细胞表达在CA;、CA;区的锥体细胞层以及齿 状回与正常组比较有所增加,但与VD组比较则明显减少。实验结果提示; 针刺对VD大鼠海马缺血损害区和抗缺血损害区HO-lmRNA及蛋白得表达 具有调节作用。 总结上述结果显示,依据中医学和针灸学理论,采用益肾填髓,聪 脑启智,涤痰化瘀为治疗原则,选百会、肾俞、足三里组方,对VD大鼠 进行电针治疗,取得了较好的效果:有效改善VD大鼠学习记忆能力,有 效阻止脑部海马神经元的损害。提示针刺可应用于VD的治疗;而且,治 疗时问以早期为好。实验通过新基因的筛选、克隆,以及BDNF、HO-1 两个已知基因的研究,提示VD发病可能与基因密切相关,VD是一个受多 种基因调控的疾病;还提示针刺可能是通过调节海马内多种已知或未知 相关基因的表达,从而达到治疗VD的目的。实验发现的新基因片段的功 能研究将是今后进一步的研究工作。


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