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从痰浊阻肺大鼠模型初探痰邪致病机理

吴秀艳  
【摘要】:目的:本课题以中医理论为指导,建立了痰浊阻肺模型,通过观察大鼠一般表现和酚红排痰实验、肺组织病理形态改变、粘蛋白MUC5AC表达等客观指标综合来评价模型。通过检测肺泡巨噬细胞的膜流动性和超微结构的变化、肺泡巨噬细胞分泌TNF-α和NO的含量、肺泡巨噬细胞和血清中自细胞粘附分子CD11a、CD11b、CD18、CD54、CD62L的表达及肺组织中NF-κB、COX-2mRNA的表达,来探讨痰邪致病的细胞和分子机制。并观察化痰方对这些指标的影响,以反证模型,同时阐明其抗炎和免疫调节作用的机制。 方法:健康SD大鼠,体重180~200g,48只,随机分为三组:痰浊阻肺组(模型组)、化痰方组(治疗组)、生理盐水组(正常组)。予二氧化硫烟薰和冷风刺激造模。①观察大鼠咳嗽,气喘,口鼻分泌物,活动状况,毛发光泽度,粪尿,食量,体重等一般情况和酚红排痰实验观察各组大鼠支气管痰的分泌情况;②观察各组大鼠HE染色的肺组织病理改变;③采用免疫组化方法测定各组大鼠粘蛋白(MUC)5AC的表达;④大鼠处死后,进行支气管肺泡灌洗,收集肺泡巨噬细胞(AM),采用荧光偏振法以DPH做探针观察各组大鼠肺泡巨噬细胞膜流动性的变化;⑤透射电镜下观察肺泡巨噬细胞的超微结构;⑥收集纯化的肺泡巨噬细胞,培养24小时后,收集培养上清,用双抗体夹心法测定肺泡巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)含量,用生化法测定一氧化氮(NO)的含量;⑦用流式细胞仪检测肺泡巨噬细胞和血中白细胞粘附分子CD11a、CD11b、CD18、CD54(ICAM-1)、CD62L的表达⑧采用逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)检测各组大鼠肺组织环氧合酶(COX-2)mRNA的表达;⑨用免疫组化方法测定各组大鼠肺组织核转录因子κB(NF-κB)的表达。 结果:①模型组大鼠普遍可听见明显的气道痰鸣音,并有咳嗽,气喘,逆毛,体毛干枯无光泽,拱背蜷睡,少动,反应迟钝,食少,大便稀,身体消瘦等症状。酚红排痰实验示模型组大鼠酚红排泄明显增高,与正常组比较有显著性差异(P0.01),中药治疗后酚红排泄明显减低,与模型组比较有显著性差异(P0.05);②组织形态学改变可见模型组大鼠气管、支气管纤毛柱状上皮细胞部分剥脱,杯状细胞增生,分泌旺盛;中药化痰治疗后,上述病理损害明显减轻;③模型大鼠MUC5AC高于正常组(P0.05),中药治疗后MUC5AC的表达明显降低,与模型组比较有显著性差异(P0.05);④模型组大鼠肺泡巨噬细胞膜流动性明显降低,与正常组比较有显著性差异(P0.05),中药治疗后膜流动性明显增高,与模型组比较有显著性差异(P0.05);⑤超微病理结果显示模型组肺泡巨噬细胞最突出的变化是胞质中有更多的溶酶体,甚至有髓鞘样改变,内质网及核糖体增加,出现较多的高尔基小泡,伪足减少;中药化痰治疗后,上述病理损害明显减轻;⑥模型组肺泡巨噬细胞分泌TNF-α、NO高于正常组(P0.01), 博一卜学位论文 从痰浊阻肺大鼠模型初探痰邪致病机理 中药治疗后,此二项指标均明显降低,与模型组比较有显著性差异(P0.01); ⑦模型组肺泡巨噬细胞和血中白细胞CD 1 la、CDllb、CD18、CD54、Cn62L的 表达均高于正常组(P0.01),中药治疗后,粘附分子表达降低,与模型组比较 有显著性差异(P0.01);⑧模型组cox一ZmRNA的表达高于正常组(P0.01), 中药治疗后,COX一ZmRNA的表达明显降低,与模型组比较有显著性差异 (P0.01);⑨模型组肺组织NF一KB的表达高于正常组(P0.01),中药治疗后NF- KB的表达明显降低,与模型组比较有显著性差异伊0.01)。 结论:①造模后,大鼠出现了痰浊阻肺的临床表现,同时酚红排痰实验、病 理切片和痰中主要成分MUCSAC在杯状细胞的表达升高客观证实了痰浊阻肺模 型的成功.中药化痰方治疗后,痰液分泌减少,少量杯状细胞增生,MIJCSAC 的表达明显降低,客观证实了中药具有化痰作用,其作用机理可能是抑制杯状细 胞增生,从而减少了气道粘液的过多分泌和粘蛋白的表达而达到化痰作用.②通 过肺泡巨噬细胞形态和功能的检测,可见肺泡巨噬细胞激活,翔F一a、NO含量 增加和粘附分子CD 1 la、CD 1 lb、CD 18、CD54、CD62L表达增高在痰邪致病中 发生了重要作用。中药治疗后,NO和翔F一a的含量均比模型组降低,说明了 化痰作用后能减轻NO和mF一a的致炎作用.中药治疗后粘附分子cDlla、 CD llb、CD18、CD54、CD62L表达均明显下降,说明化痰中药能起到抗白细胞 一内皮细胞粘附的作用,阻止炎症病程发展。③COX一2参与了痰邪致病,其在致 病过程中发生作用可能是其作用产物PGs相互作用的结果。中药治疗组 COX一ZmRNA表达水平降低,表明治疗可抑制COX一ZmRNA的活性,减轻痰邪 致病过程.④痰证模型中存在NF一KB的活化,NF一KB活化在痰邪致病中发挥了 重要作用。其作用机制可能是调控细胞因子、粘附分子、环氧合酶一2的表达而参 与致病。中药治疗后对NF一KB的表达具有一定的抑制作用,这可能是中药的免 疫调节和抗炎作用的分子生物学机制一个方面.⑤细胞因子、粘附分子和环氧合 酶一2之间是相互影响,相互作用的。如炎性因子TNF一a和NO之间可以相互影 响,炎性因子又影响粘附分子及环氧合酶的表达,反过来粘附分子及环氧合酶等 又作用于炎性细胞影响炎性介质的分泌,而NF一、B又能调控细胞因子、粘附分 子、环氧合酶一2的表达。总之,它们之间相互形成一个


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