乳黄片对A型肝性脑病大鼠神经递质GABA、Glu表达调控的研究

【摘要】：目的 大量研究表明在肝性脑病(hepatic encephalopathy,HE)疾病的发展过程中,抑制性神经递质γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)、兴奋性神经递质谷氨酸(glutamate,Glu)比例失衡起着重要作用。导师张赤志教授根据“上病下治”、“肝病宜疏通大肠”的中医理论,利用中药酒制大黄和微生态制剂乳酸菌素制成乳黄片治疗HE,临床和动物实验显示其有很好的降氨作用,能明显改善HE症状及相关指标,提高存活率。因此,从神经递质角度探讨该方治疗HE的作用机制,有着非常重要的意义。本实验通过建立A型HE大鼠模型,观察氨、神经递质GABA、Glu及GABA_A受体、外周型苯二氮卓受体(peripheral-type benzodiazepine receptor,PTBR)、Glu转运体(GLAST)的变化,阐明氨、神经递质及其相关受体在HE中的作用,探讨乳黄片治疗HE的靶点和可能作用机制,为中医药治疗HE提供科学依据。 方法 1.SPF级雄性Wistar大鼠96只,随机分为6组,每组16只:正常对照组(A组)、模型对照组(B组)、乳果糖组(C组)、乳黄片小中大剂量组(D、E、F组)。大鼠禁食过夜(14h以上),除A组外其余各组采用目前应用较成熟的硫代乙酰胺(TAA)诱导法(250mg·kg~(-1)体重,0h、24hTAA灌胃造模)复制A型HE动物模型。在TAA首次造模前2h,A、B组灌胃生理盐水10ml·kg~(-1)体重,C、D、E、F组给等量/体重比相应药物。以后每8h重复给药一次。自首次TAA造模至实验结束,每隔8h皮下注射3ml 10%葡萄糖、2ml含等量生理盐水与20μmol·L~(-1)KCl溶液的混合液以防止低血糖。于实验30h后行脑电图(EEG)检测,之后处置动物取材。2.眼眶取血,检测ALT、AST、TBil及TNF-α、内毒素水平、血氨、血GABA。3.取肝脏组织,制作切片,电镜观察超微结构变化。4.小脑延髓池抽取脑脊液,干化学法检测脑氨。5.取大脑皮层组织,高效液相法检测GABA、Glu,免疫组织化学染色法检测GABA_A受体表达,逆转录-多聚酶链反应法(RT-PCR)检测PTBRmRNA和Glu转运体GLASTmRNA的表达情况。 结果 1.乳黄片可以显著改善HE大鼠行为异常,提高存活率。2.B组ALT、AST、TBil、脑脊液氨、血氨、TNF-α、内毒素水平均明显高于A组(P0.01),且检测到A组检测不出的GABA。C、D、E、F组上述指标亦高于A组。治疗后C、D、E、F组上述指标较B组均有所下降,且D、E、F组均优于C组,其中,以E组 湖北中医学院 博士学位论文 下降值最多。3。电镜观察,B组大鼠肝细胞有不同程度的坏死、崩解及消失, 未坏死细胞也有严重变性,坏死组织中有较多的炎性细胞及脂滴浸润。与B组 相比,C、D、E、F组肝细胞损伤程度和损伤面积均有改善,而以E组改善最明 显。4。与A组比较,B组GABA升高,Glu下降明显,二者比值亦有所下降,均有 统计学意义(P0。01)。其余四组GABA均较B组有不同程度的下降,Glu及其与 GABA的比值均增加,有显著性差异(P0 .01),且以E组效果最佳。5。B组大鼠 GABA;阳性细胞平均数(N)及平均光密度(D)显著高于A组(P(0.01)。C、D、E、F 组均较之明显下降(P0。01),而以E组下降最显著。6.B组PTB而RNA表达上升, 治疗后C、E、F组较B组均有不同程度的下降(P0 .05);B组GLASTmRNA表达下 降,治疗后C、E、F组表达均较之升高(P0 .05)。均以E组效果最佳(P0 .05)。 结论高氨是A型肝性脑病发病的病理基础之一,其对神经递质GABA、Glu的 影响在HE的发病机理中占有重要作用。实验发现HE时,脑氨、血氨及其比值显 著升高。同时,血清内检测出正常情况下检测不到的GABA,并伴有皮层组织 GABA增加以及GABA;受体高表达,PTBIhaRNA表达上调,证实了GABA/BZ假说;另 外,还发现兴奋的神经递质Glu及其转运体GLASTmRNA表达下调。因此,综合看 来,氨引起神经递质功能紊乱可能是A型HE发病机理之一;HE时,GABA和Glu功 能失衡,导致抑制性神经递质净增,且二者的含量变化与氨有关:而乳黄片 可通过多个环节改善A型HE大鼠的GABA/Glu失衡,对抗HE,提示该方的作用靶 点不仅在降氨,而且可改善神经递质失衡。 关键词 肝性脑病/A型@乳黄片实验研究氨谷氨酸丫一氨基丁酸外周 型苯二氮卓受体谷氨酸转运体