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肾安Ⅰ号对大鼠肾小球系膜细胞增殖及TGF-β_1、HGF表达影响的实验研究

卢祖礼  
【摘要】:目的: 通过对大鼠肾小球系膜细胞的体外培养,观察肾安Ⅰ号对大鼠肾小球系膜细胞增殖及TGF-β_1和HGF表达的影响,进而探讨其阻缓肾纤维化的可能作用机制。 方法: 1.应用体外细胞培养技术,进行大鼠肾小球系膜细胞培养,并选择脂多糖为刺激物。 2.在体外培养的大鼠肾小球系膜细胞中,按不同分组:①正常组(普通培养液);②LPS组(含LPS的培养液);③肾安组(含肾安Ⅰ号的培养液),分别加入不同培养液,于培养24小时和48小时后在显微镜下进行细胞生长的形态学观察。 3.用台盼蓝染色计数法测含不同浓度肾安Ⅰ号培养液培养条件下的大鼠肾小球系膜细胞的细胞活力,观察肾安Ⅰ号对大鼠肾小球系膜细胞的毒性作用,从而确定实验用含肾安Ⅰ号培养液的合理浓度。 4.在体外培养的大鼠肾小球系膜细胞中,按不同分组:①空白组,即GMC组(普通培养液);②对照组,即LPS组(含LPS的培养液);③肾安低剂量组(含低浓度肾安Ⅰ号的培养液);④肾安中剂量组(含中等浓度肾安Ⅰ号的培养液);⑤肾安高剂量组(含高浓度肾安Ⅰ号的培养液),分别加入受试品,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,于24小时、48小时和72小时观察各组标本中大鼠肾小球系膜细胞增殖水平,进而选择药物作用的最佳浓度及时间段。 5.在体外培养的大鼠肾小球系膜细胞中,按不同分组:①空白组,即GMC组(普通培养液);②对照组,即LPS组(含LPS的培养液);③治疗组,即肾安组(含肾安Ⅰ号的培养液),分别加入受试品,采用免疫细胞化学技术法观察各组标本中大鼠肾小球系膜细胞表达TGF-β_1和HGF的情况。 结果: 1.大鼠肾小球系膜细胞的体外培养结果 经传代培养后的大鼠肾小球系膜细胞,一般24小时全部贴壁,纯度极高,生长迅速,很快融合成片,密集时可重叠生长,2-3天即可进行传代培养。细胞培养成功且符合实验要求。 2.大鼠肾小球系膜细胞形态学观察结果 在倒置显微镜下观察,可见正常组大鼠肾小球系膜细胞体积较大,且纯度极高,形态多为梭形或星形。经HE染色后,位相显微镜下见细胞结构十分清晰,胞浆内可见大量微丝样结构,核居中央,多呈圆形或椭圆形,核周胞质散布大量的细胞小颗粒。与相关文献报道一致。 经LPS处理24小时后,光镜下可见LPS组大鼠肾小球系膜细胞增生明显,细胞体积增大,但附壁能力弱,易脱落,相邻细胞间连接性有所降低。48小时后大鼠肾小球系膜细胞细胞体积有所缩小,形态变圆,核固缩开始出现,核颜色加深,折光性增强。 澎砖尹硬梦陀 叨士矛斌必丈 而经中药肾安I号处理的肾安组大鼠肾小球系膜细胞贴壁生长良好,几乎 无脱落,胞浆饱满,相邻细胞生长融合成片。形态学观察与正常组一致。 3.大鼠肾小球系膜细胞毒性试验结果 经台盼蓝染色排斥试验显示:肾安I号25%,12.5%和6.25W0浓度组24小 时,48小时和72小时细胞活力均达90%以上。经XZ检验,肾安I号上述三组细胞 活力与空白组比较,无显著性差异(P0.05)。 4.大鼠肾小球系膜细胞增殖测定结果 MTT法测0D值显示:(1)肾安I号24小时和48小时对大鼠肾小球系膜细 胞的抑制作用与浓度呈显著的正相关关系(r=o.992和0.976,P0.05);(2) LPS 组大鼠肾小球系膜细胞增生水平明显高于GMC组(P0 .05或P0 .01);肾安I号各 浓度组大鼠肾小球系膜细胞增生水平明显低于LPS组(P0 .05或P0 .01)。 5.大鼠肾小球系膜细胞中TGF一p,、HGF表达结果 免疫细胞化学染色(48h组)显示:(l)三组标本中均有不同程度的TGF一p: 和HGF的阳性表达;(2)LPS组TGF一p.表达明显高于GMC组(P(0.05),而HGF表 达与GMC组无显著性差异(P0 .05);(3)肾安组TGF一p.表达与GMC组无显著性差 异(P)0.05),而HGF表达明显高于GMC组(P(0.01):(4)肾安组TGF一p,表达明显 低于LPS组(P(0.01),而HGF表达明显高于LPS组(P(0.01)。 结论: 本研究表明: 1.肾安I号对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞无明显细胞毒性作用; 2.LPS能明显刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖,而肾安I号能 明显抑制LPS刺激培养条件下的大鼠肾小球系膜细胞增殖,具有阻缓肾纤维化的 作用; 3.LPS能明显刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞TGF一p,高表达;而肾 安I号能够下调LPS刺激培养条件下大鼠GMC中TGF一pl的表达,同时上调HGF的 表达,且可能是其阻缓肾纤维化的分子作用机理之一; 4.大鼠肾小球系膜细胞是肾安I号发挥作用的重要靶细胞。 主题词:肾小球;系膜细胞/增殖;生长因子; 大鼠;实验研究; @肾安I号


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