清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM PI3K信号转导影响的比较研究

【摘要】： 1.目的 中医药在DM的治疗上,无论改善症状,还是防治并发症均有较好的效果,且副作用小,体现出整体辨证论治、求本治本、多效能调整治疗的优势。本课题在前期翻白草能有效降血糖、保护胰岛B细胞的研究基础上,结合中医辨证论治的思维原则、中医对DM病因病机和病程演变的理解,拟对清热解毒、滋阴清热、活血化瘀对T2DM及其血管病变、对骨骼肌细胞胰岛素PI3K信号转导的影响进行比较研究,分别选用翻白草、生地、丹参代表清热解毒、滋阴清热、活血化淤。观测清热解毒与滋阴清热、活血化淤对T2DM大鼠糖代谢影响的比较;对T2DM大鼠血清NO和ET影响的比较;对T2DM大鼠腹主动脉超微结构影响的比较;对T2DM大鼠骨骼肌超微结构影响的比较;对T2DM大鼠骨骼肌PI3K信号转导上的影响.旨在从信号转导通路的角度探索清热解毒、滋阴清热、活血化瘀防治DM及其并发症的实质,探讨热毒在DM及其并发症发生发展过程中的地位,为中医药防治DM的研究提供新思路。 2.方法 2.1理论研究:对DM的流行病学、病因及发病机制、分型及诊断、治疗以及其并发症发病机制等进行系统文献复习研究,查阅近年来国内外的相关研究文献资料,对资料进行较为系统的总结和综述,掌握相关研究项目和指标的科研前沿动态。对传统中医理论关于DM病因病机、辨证论治、治法、方药的文献进行系统复习研究,查阅近年来中医学的相关研究文献资料,对资料进行较为系统的总结和综述,掌握相关文献资料的研究成果和研究动态。 2.2实验研究:(1)Wistar大鼠84只,随机选取7只为正常组:其余77只予以高热量高糖高脂饮食加链脲佐菌素(STZ)腹腔注射造模,造模成功后随机分为模型组、格列奇特组、翻白草大、中、小剂量组、丹参大、中、小剂量组和生地大、中、小剂量组,每组7只.造模结束后改为普通饮食,分别予以相应药物进行治疗,连续4周。(2)分别于治疗开始前、治疗结束后称量体重。(3)分别于治疗开始前、治疗结束后,采末梢血,使用罗氏优越血糖仪检测血糖。(4)分别于开始治疗前、治疗结束后,采静脉血,采用放射免疫分析法检测血清胰岛素。(5)分别于治疗开始前、治疗结束后,采静脉血,采用硝酸还原酶法检测血清一氧化氮(NO)。(6)分别于治疗开始前、治疗结束后,采用放射免疫分析法检测血清内皮素(ET)。(7)实验结束后,处死大鼠,取腹主动脉,制作超薄切片,醋酸铀-枸橼酸铅双重染色,电镜观察腹主动脉超微结构。(8)实验结束后,处死大鼠,取腹壁肌,制作超薄切片,醋酸铀-枸橼酸铅双重染色,电镜观察骨骼肌细胞超微结构。(9)实验结束后,处死大鼠,取腹壁肌,采用蛋白质SDS-PAGE电泳、免疫印迹法等方法,检测骨骼肌细胞磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)、葡萄糖转运蛋白4(GluT4)蛋白的表达。 3.结果 (1)理论研究:中医历代先贤诸家的论述明确指出消渴之为病,不论何种原因、在何病位,皆由热火内盛、怫郁结滞,耗伤阴津,导致津液亏损所致;消渴并发症的发生亦与燥热炽盛有关,如消渴并发痈疽便是热火炽盛之明证。而“毒者,邪气蕴结不解之谓”,“邪盛谓之毒”,热火炽盛、蕴结持久而为热毒。故而认为热毒是促使DM发生发展和产生并发症的基本致病因素和重要病理机制。另外,清热解毒法治疗DM得到了临床的验证,确有疗效,也反证了热毒在DM病因病机中的地位。 (2)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠糖代谢的影响:翻白草大、中剂量组、丹参大、中剂量组和生地大、中、小剂量组大鼠体重显著增加(P＜0.01);翻白草小剂量组、丹参小剂量组体重明显增加(P＜0.05);翻白草中剂量组体重增幅高于生地中剂量组,但两者比较无统计学意义;翻白草中剂量组体重增幅显著高于丹参中剂量组(P＜0.01),生地中剂量组体重增幅明显高于丹参中剂量组(P＜0.05)。 翻白草大剂量组血糖治疗前后相比明显降低(P＜0.05);翻白草中、小剂量组血糖治疗前后相比均显著降低(P＜0.01)。丹参大、中、小剂量组血糖治疗前后相比均有所降低,但无统计学意义(P＞0.05)。生地大、中剂量组血糖治疗前后相比均有显著降低(P＜0.01);生地小剂量组血糖治疗前后相比明显降低(P＜0.05);翻白草中剂量组血糖降幅大于生地中剂量组,但两者比较无统计学意义(P＞0.05);翻白草、生地中剂量组血糖降幅显著大于丹参中剂量组(P＜0.01)。 翻白草大、中、小剂量组血清INS治疗前后相比显著升高(P＜0.01)。丹参大、中、小剂量组血清INS治疗前后相比显著降低(P＜0.01);生地大剂量组血清INS治疗前后相比显著升高(P＜0.01);生地中、小剂量组血清INS治疗前后相比明显升高(P＜0.05);翻白草中剂量组血清INS增幅高于生地中剂量组,但无统计学意义(P＞0.05)。 (3)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠血管活性因子的影响:翻白草大、中剂量组大鼠血清NO治疗前后显著降低(P＜0.01),小剂量组明显降低(P＜0.05);丹参大剂量组大鼠血清NO治疗前后显著降低(P＜0.01),中、小剂量组明显降低(P＜0.05);生地大、中剂量组大鼠血清NO治疗前后显著降低(P＜0.01),小剂量组明显降低(P＜0.05);丹参各剂量组NO降幅最大,生地相应剂量组次之,翻白草相应剂量组再次之,但无统计学意义(以中剂量组比较)(P＞0.05);三者的各剂量组中,均以大剂量组效果为最好,中剂量组次之,小剂量组再次之,但三者的各剂量组之间比较均无显著性差异(P＞0.05)。 翻白草、丹参、生地各剂量组大鼠血清ET治疗前后均显著降低(P＜0.01);翻白草各剂量组大鼠血清ET降幅均大于生地各相应剂量组,但无统计学意义(P＞0.05);翻白草、生地各剂量组大鼠血清BT降幅均显著大于丹参各相应剂量组(P＜0.01);三者各剂量组中均以大剂量组ET降幅最大、中剂量组次之、小剂量组再次之,三者各剂量组中的大剂量组ET降幅均显著大于小剂量组(P＜0.01),余皆无差异(P＞0.05)。 (4)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠腹主动脉超微结构的影响:模型组腹主动脉血管内皮细胞(VEC)结构受损较重,通透性增高,细胞肿胀、脱落;血管平滑肌细胞(VSMC)增殖并向内膜迁移,胶原纤维增生、管壁硬化,线粒体肿胀。格列奇特组、翻白草各剂量组、丹参各剂量组、生地各剂量组腹主动脉VEC、VSMC的损伤有不同程度减轻;其中翻白草、丹参、生地各剂量组中均以大剂量效果最好、中剂量次之、大剂量再次之;翻白草、生地各相应剂量组效果基本相当,而均优于丹参各相应剂量组。 (5)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠骨骼肌超微结构的影响:T2DM模型组大鼠骨骼肌组织结构受损严重,主要表现为肌原纤维排列紊乱、断裂;肌节结构不完整且模糊;线粒体体积增大,部分线粒体明显肿胀、电子密度低,线粒体嵴排列紊乱或中断或肿胀;糖原颗粒显著增多,有较多脂滴;间质内有明显的胶原纤维增生。翻白草各剂量组、丹参各剂量组、生地各剂量组大鼠骨骼肌组织损伤均较模型组有不同程度的减轻,且均以大剂量组效果最好、中剂量组次之、小剂量组损伤再次之;其中翻白草与生地的相应剂量组的效果基本相当,而优于丹参的相应剂量组。 (6)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠骨骼肌PI3K信号转导的影响:模型组大鼠骨骼肌PI3K蛋白表达量明显低于正常组(P＜0.05)。翻白草各剂量组大鼠骨骼肌PI3K蛋白表达量均高于正常组,其大剂量组与正常组比较有显著性差异(P＜0.05),而中、小剂量组与正常组比较无显著性差异(P＞0.05);其各剂量组PI3K蛋白表达量显著高于模型组(P＜0.01);其各剂量组PI3K蛋白表达量以大剂量组最大、中剂量组次之、小剂量组再次之,其大剂量组与小剂量组比较有显著性差异(P＜0.05),余者无差异(P＞0.05)。丹参各剂量组大鼠骨骼肌PI3K蛋白表达量均明显低于正常组(P＜0.05);而略低于模型组,但统计学意义(P＞0.05);其各剂量组相互比较无差异(P＞0.05)。生地各剂量组大鼠骨骼肌PI3K蛋白表达量均高于正常组,其中大剂量组与正常组比较有显著性差异(P＜0.05),而中、小剂量组与正常组比较无显著性差异(P＞0.05);其各剂量组中以大剂量组表达量最大、中剂量组次之、小剂量组再次之,但相互比较无统计学意义(P＞0.05)。翻白草各剂量组大鼠骨骼肌PI3K蛋白表达量均高于生地各相应剂量组,但均无统计学意义(P＞0.05);两者各剂量组PI3K蛋白表达量均显著或明显高于丹参各相应剂量组,其中翻白草大、中剂量组、生地大剂量组与丹参各相应剂量组比较有非常显著性差异(P＜0.01),余者与丹参相应剂量组比较有显著性差异(P＜0.05)。 模型组大鼠骨骼肌PDK1蛋白表达量明显低于正常组(P＜0.05)。翻白草各剂量组大鼠骨骼肌PDK1蛋白表达量均高于正常组,但均无统计学意义(P＞0.05);其各剂量组PDK1蛋白表达量均显著性高于模型组(P＜0.01);其各剂量组中以大剂量组表达量最大、中剂量组次之、小剂量组再次之,但相互比较无统计学意义(P＞0.05)。丹参各剂量组大鼠骨骼肌PDK1蛋白表达量均明显低于正常组(P＜0.05);其各剂量组PDK1蛋白表达量与模型组比较均无显著性差异(P＞0.05);其各剂量组相互比较无显著性差异(P＞0.05)。生地各剂量组大鼠骨骼肌PDK1蛋白表达均高于正常组,但均无统计学意义(P＞0.05);其各剂量组中以大剂量组PDK1蛋白表达量最大、中剂量组次之、小剂量组再次之,但相互比较无统计学意义(P＞0.05)。翻白草各剂量组大鼠骨骼肌PDK1蛋白表达量均高于生地各相应剂量组,但均无统计学意义(P＞0.05);两者各剂量组PDK1蛋白表达量均显著高于丹参各相应剂量组(P＜0.01)。 模型组大鼠骨骼肌GluT4蛋白表达量明显低于正常组(P＜0.05)。翻白草各剂量组大鼠骨骼肌GluT4蛋白表达量与正常组比较均无显著性差异(P＞0.05);其各剂量组GluT4蛋白表达量均明显高于模型组(P＜0.05);其各剂量组中以大剂量组表达量最大、中剂量组次之、小剂量组再次之,但相互比较无统计学意义(P＞0.05)。丹参各剂量组大鼠骨骼肌GluT4蛋白表达量均低于正常组,但均无统计学意义(P＞0.05);其各剂量组GluT4蛋白表达量均略高于模型组,但均无统计学意义(P＞0.05);其各剂量组相互比较无显著性差异(P＞0.05)。生地各剂量组大鼠骨骼肌GluT4蛋白表达量与正常组比较均无显著性差异(P＞0.05);其各剂量组中以大剂量组表达量最大、中剂量组次之、小剂量组再次之,但相互比较无统计学意义(P＞0.05).翻白草各剂量组大鼠骨骼肌GluT4蛋白表达量均高于生地各相应剂量组,但均无统计学意义(P＞0.05);两者各剂量组GluT4蛋白表达量均高于丹参各相应剂量组,其中两者大剂量组与丹参大剂量组比较有显著性差异(P＜0.05),余无统计学意义(P＞0.05)。 4.结论 (1)热毒是促使DM发生发展和产生并发症的基本致病因素和重要病理机制。 (2)清热解毒与滋阴清热均能有效降低T2DM大鼠血糖,两者作用效果基本相当,但清热解毒略优于滋阴清热;活血化瘀则不能有效降低血糖.翻白草降血糖作用的机理可能是:①保护胰岛B细胞,促进INS分泌;②上调胰岛素敏感组织骨骼肌细胞胰岛素信号转导,增加血糖向骨骼肌细胞内转移。生地降血糖作用的机理可能是:①促进INS分泌;②上调胰岛素敏感组织骨骼肌细胞胰岛素信号转导,增加血糖向骨骼肌细胞内转移。丹参不能有效促进INS分泌,亦不能上调骨骼肌细胞胰岛素信号转导,从而不能有效控制DM大鼠血糖。 (3)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀均能有效降低T2DM大鼠VEC损伤,减少VSMC增生,从而达到防治糖尿病大血管病变的目的。清热解毒、滋阴清热的作用效果相当,但清热解毒略优于滋阴清热;两者均优于活血化瘀。翻白草、生地防治大血管病变的作用机理可能是:①有效地降低血糖,减少高血糖毒性对VEC、VSMC的损害;②降低VEC分泌ET,减少ET对VEC、VSMC的损害;③下调NO的生成,降低高浓度NO的细胞毒性作用。丹参防治大血管病变的作用机理可能是:①降低VEC分泌ET,减少ET对VEC、VSMC的损害;②下调NO的生成,降低高浓度NO的细胞毒性作用。 (4)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀均能有效保护骨骼肌组织,减轻骨骼肌组织损伤。清热解毒与滋阴清热的效果相当,但清热解毒略优于滋阴清热;两者均优于活血化瘀。翻白草、生地防治糖尿病骨骼肌病变的作用机理可能是:①有效促进INS分泌、降低T2DM大鼠血糖,改善糖代谢紊乱,进而降低高血糖毒性所介导的骨骼肌损伤;②上调骨骼肌细胞胰岛素信号转导,促进葡萄糖向骨骼肌细胞转运,促进血糖利用,保护骨骼肌功能。丹参防治糖尿病骨骼肌病变的作用机理可能是:通过其有效成分丹酚酸类化合物的强抗氧化作用,清除氧自由基,降低ROS的毒性作用,实现对骨骼肌结构和功能的保护。