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江南卷柏提取物抗柯萨奇病毒和单纯疱疹病毒的研究

殷丹  
【摘要】: 江南卷柏(Selaginella moellendorfii Hieron)是卷柏科卷柏属植物江南卷柏的干燥全草,为常用中草药与民族药。具有清热解毒、抗癌、止血之功效,用于癌症、肺炎、急性扁桃体炎、眼结膜炎和乳腺炎等症。云南彝族主要用于治疗黄疸型肝炎、肺结核咯血、全身浮肿等症。鄂西土家族尚用于癌症、腹泻、淋病、小儿惊风、吐血、便血、崩漏、痔疮出血,外用则治烧烫伤、外伤出血。并且,以本品为原料制得的江南卷柏片对原发性血小板减少性紫癫、过敏性紫癫、继发性紫癫及多种出血症均有良效。 目前,中外植物化学工作者已从卷柏属植物中分离出黄酮类、生物碱类、酚类、有机酸类、氨基酸及多糖类等多种化学成分。其研究工作主要集中在植物的乙酸乙酯及正丁醇萃取部位,并从前者中成功分离了几十个黄酮类化合物,且除芹菜素外大多为双黄酮类。其中,穗花杉双黄酮(amentoflavone)不仅含量通常为最高,且最早即被1971年Okigawa等人从卷柏中分离得到。 我们课题组从卷柏属植物分离得到19个双黄酮化合物、1个黄酮类化合物和1个黄酮苷化合物,其中5个为新化合物,15个成分为首次从这些植物中发现,它们都具有一定程度抑制XOD、LOX或/和COX-2的活性;发现穗花衫双黄酮、罗波斯塔黄酮和罗波斯塔黄酮-4′-甲醚3种双黄酮成分为卷柏属植物共同的特征性成分,它们具有不同程度的抗氧化、抗病毒或抗肿瘤活性,是共同的活性指标成分。其中从江南卷柏的活性部位分离得到了6个双黄酮类化合物,经鉴定为鸡毛松双黄酮A(7,4′,7″-tri-O-methylrobustaflavone,Ⅰ)、鸡毛松双黄酮B(7,7″-di-O-methylrobustaflavone,Ⅱ)、罗波斯塔黄酮-4′-甲醚(4′-O-methylrobustaflavone,Ⅲ)、罗波斯塔黄酮(robustaflavone,Ⅳ),扁柏双黄酮(hinokiflavone,Ⅴ)和穗花杉双黄酮(amentoflavone,Ⅵ)。其中,化合物Ⅰ-Ⅴ为首次从江南卷柏中分离得到,化合物Ⅰ和Ⅱ(鸡毛松双黄酮A和B)属于罗波斯塔黄酮类,只被报道发现于裸子植物罗汉松科罗汉松属的鸡毛松(Podocarpus imbricatus),这是首次从其它植物和卷柏属植物中分离得到。 研究中还发现,卷柏属植物江南卷柏、细叶卷柏及薄叶卷柏等均具有良好的体外抗柯萨奇病毒效果。其中,江南卷柏的乙酸乙酯提取物不仅可直接杀死病毒,还能有效抑制病毒的生物合成。而乙酸乙酯部位的主要特征成分之一是黄酮类化合物,故我们从江南卷柏药材中提取出有效部位总黄酮成分,并考察其工艺和质量,从而初步制定江南卷柏总黄酮提取物的制备工艺与质量标准。然后,以此提取物进行了多次体外和体内抗柯萨奇病毒(CVB3)和单纯疱疹病毒(HSV-I)的研究,取得了肯定且可靠的效果。 首先,在江南卷柏提取物制备工艺方面,我们通过单因素试验考察其粗提方法,确定为乙醇回流法;再以总黄酮提取量和浸膏得率为考察指标,用正交试验法对乙醇回流提取工艺进行考察,确定其最佳工艺条件为药材9倍量的85%乙醇回流提取2次,每次1小时;接着以穗花杉双黄酮提取量和浸膏得率为考察指标,用正交试验法对醇提物的石油醚脱脂工艺进行考察,确定其最佳工艺条件为用原药材6倍量的石油醚回流提取2次,每次1小时;脱脂后以低浓度稀醇溶液溶解过滤,再用大孔树脂进行纯化分离,得到最终产品:总黄酮粉末。具体即以总黄酮的含量和回收率为考察指标,通过单因素试验对树脂的型号、药材上样量、洗脱剂浓度和体积、洗脱流速及树脂重复使用次数进行考察,确定其最佳工艺为用D101型大孔树脂对其进行吸附纯化,树脂量:药材量为3∶1,以8BV70%乙醇溶液在2BV/h的流速进行洗脱,树脂的重复使用次数为3次。 在江南卷柏提取物质量标准方面,以紫外分光光度法和高效液相色谱法对提取物的总黄酮含量及穗花杉双黄酮含量进行测定,并进行方法学考察,规范以上述制备工艺所制得总黄酮提取物,其总黄酮含量不少于50.0%,穗花杉双黄酮含量不少于35.0%。 同时,我们还制定了江南卷柏药材的质量标准,确定其名称、来源、性状、鉴别、含量测定、炮制、性味归经、功能与主治、用法与用量及贮藏。在含量测定中,是以穗花杉双黄酮为对照品,采用高效液相色谱法,测定穗花杉双黄酮的含量,并进行了方法学考察。最后暂定本品以干燥品计含穗花杉双黄酮不得少于0.30%。 接着,对江南卷柏提取物的体外抗病毒作用进行了研究。我们选择柯萨奇病毒(CVB3)及单纯疱疹病毒(HSV-I),根据其复制周期,设计药物抗病毒作用的三种途径(抗病毒吸附、对病毒直接灭活、对病毒增殖的抑制作用),分三个处理组进行试验。细胞毒性试验表明,江南卷柏提取物的TC50为60μg/ml。故在此范围内确定5,10,20,30,40,50μg/ml作为药物终浓度进行抗病毒试验。实验结果显示,抗CVB3效果方面,其直接灭活病毒作用的IC50为36μg/ml,最高病毒抑制率为60%,TI为1.7;其抑制病毒增殖作用的IC50为16μg/ml,最高病毒抑制率为70%,TI为3.8。抗HSV-I效果方面,其直接灭活病毒作用的IC50为21μg/ml,最高病毒抑制率为80%,TI为2.9;其抑制病毒增殖作用的IC50为12μg/ml,最高病毒抑制率为90%,TI为5.1。实验结果说明江南卷柏提取物不仅细胞毒性较低,且具有较好的直接杀死病毒和抑制病毒生物合成的作用,其生物效价较高。 最后,我们对江南卷柏提取物在体内抗柯萨奇病毒的疗效进行了重点研究。小鼠的动物急性毒性试验表明,当以0.2ml/10g一次性灌胃、给药浓度依次为4.0,5.0,6.3,7.9,10mg/g时,其死亡率分别为10%,30%,60%,80%,100%,故确定江南卷柏标准提取物的LD50为6.2mg/g。则在此范围内确定0.9,0.3,0.1mg/g作为高、中、低三种药物浓度进行抗病毒治疗。 选取小鼠(km SPF级雄性,体重10±2g)作为试验动物,用0.2mlCVB3原液(TCID50为10~(-7))腹腔注射建立了病毒感染诱发小鼠病毒性心肌炎致病模型,然后分别设立高、中、低三种浓度的药物治疗组,正常对照组,病毒模型对照组和阿昔洛韦阳性药物对照组,于病毒感染后24h开始治疗,采取灌胃给药形式,每日一次,其余各组则采用生理盐水灌胃,每日一次,连续治疗15天。结果表明,当药物浓度为0.1mg/g时,其治愈率为30%,死亡率为50%;当药物浓度为0.3mg/g时,其治愈率为50%,死亡率为20%;当药物浓度为0.9mg/g时,其治愈率为70%,死亡率为10%。综合各项考察指标,结果显示总黄酮提取物能有效抑制柯萨奇病毒在小鼠体内的增殖,保护其脏器组织,明显减轻发病症状,推迟死亡时间,降低死亡率,治疗呈现明显的量效关系。 本文研究发现,江南卷柏提取物的细胞毒性(TC50为60μg/ml)和动物毒性(LD50为6.2mg/g)均较小,在体外有显著抑制柯萨奇病毒和单纯疱疹病毒增殖的作用,体内能有效地治疗柯萨奇病毒感染诱发的病毒性心肌炎小鼠,是一种新的潜在性有效的抗柯萨奇病毒和单纯疱疹病毒的药物。江南卷柏在民间已经用于多种病毒性疾病,本研究为治疗危急性的病毒性心肌炎提供了新的依据和希望,为抗病毒药物的研究开发,提供了新的选择。


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