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电针关元、足三里对衰老模型大鼠T细胞免疫调控机制研究

刘建民  
【摘要】: 目的:深入观察电针关元、足三里对D-半乳糖衰老模型大鼠的神经-内分泌-免疫网络相关物质的调节效应,探索针灸调控T细胞免疫延缓衰老的科学方法和作用机制。 方法:立足中医和现代医学对于衰老的科学认识,制作D-半乳糖致衰老大鼠80只(雌雄各半)作为衰老模型,随机分组设衰老模型(Model)组×2、衰老模型电针(EA)组×2、衰老模型免疫抑制(ISU)组、衰老模型电针加免疫抑制(EA+ISU)组、衰老模型米非司酮(RU486)组、衰老模型米非司酮加电针(RU486+EA)组,每组各10只,另以3月龄大鼠作为正常青年对照(Normal)组10只(雌雄各半)×2。采用电针(HANS,LH202型电针仪,连续波,频率2Hz,强度为1mA,通电15分钟)关元、后三里治疗,每日1次,每周日休息1天,共治疗27天;采用MTT法检测T细胞增殖能力,双抗夹心ELISA法检测脾脏T细胞诱生IL-2和IL-2R水平,放射免疫法检测血清IL-6、ACTH、CORT含量,流式细胞术检测血清CD8~+CD28~+T细胞表达,免疫组织化学ABC法检测海马区IL-6R、下丘脑β-end和CRH免疫阳性物表达,荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测海马和胸腺细胞GRmRNA表达等,分析各组大鼠免疫系统和神经内分泌系统相关指标的变化及联系。为探讨电针强壮穴的“治未病”效应,借助环磷酰胺腹腔注射,检验电针强壮穴(关元、足三里)对衰老机体的免疫抗病能力影响;另借助糖皮质激素受体拮抗剂米非司酮(RU486)皮下注射,探讨海马对下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的负反馈调节在电针调节免疫效应中的作用。 结果: 1.Model组T细胞增殖能力、T细胞分泌IL-2及IL-2R水平、T细胞表面抗原CD28表达均明显低于Normal组(P0.01);电针强壮穴治疗后,EA组T细胞增殖及诱生IL-2和IL-2R的水平、T细胞表面抗原CD28的表达均提高(P0.01);电针对衰老模型大鼠T细胞增殖能力的调节与IL-2及其受体、CD8~+CD28~+T细胞密度呈正相关; 2.ISU组衰老大鼠经免疫抑制剂腹腔注射后,与Model组比较T细胞增殖指数、T细胞诱生IL-2、IL-2R分泌、CD8~+CD28~+T细胞密度明显降低(P0.01,P_(IL-2)0.05);EA+ISU接受电针处置后,上述指标与未电针的ISU组比较却有显著性差异(P0.01,)与Model组比较未见明显差异(P0.05); 3.Model组外周血IL-6的分泌和海马区IL-6R表达,比Normal组明显升高(P0.01),电针强壮穴后,在提高衰老模型大鼠T细胞增殖能力同时,能降低外周血IL-6分泌和海马IL-6R表达水平(P0.01); 4.下丘脑弓状核β-end免疫组织化学结果,β-end免疫阳性物主要分布在下丘脑弓状核,高倍镜下神经元和部分神经胶质细胞胞浆内可见棕褐色阳性颗粒,神经元轴突免疫反应物呈串珠状。光镜下Model组神经元胞体数比Normal组分布少,经电针强壮穴处理的EA组呈现增多趋势;光密度(OD)值分析表明,与Normal组比较,Model组明显降低(P0.01);经电针处置后的大鼠EA组与Model组比较,β-end阳性反应物OD值明显升高(P0.05),与Normal组比较无明显差异性(P0.05)。 5.下丘脑CRH免疫组织化学检测结果,CRH免疫阳性物主要分布在弓状核、室旁核,其中室旁核比较明显,高倍镜下可见CRH免疫阳性物呈棕褐色,分布于大细胞神经元的胞浆内,经D-半乳糖处理造模的Model组比组胞浆内CRH明显减少,而经过电针强壮穴处理的EA组胞浆内CRH呈明显上升趋势;CRH免疫阳性物OD值分析表明,Model组OD值较Normal组大鼠明显减少(P0.05),经电针强壮穴治疗后的EA组灰度值显著升高(P0.05),EA组与Normal组之间OD值比较无统计学差异(P0.05); 6.与Normal组比较,Model组T细胞增殖能力降低,其血清ACTH和CORT含量却明显升高(P0.01),而经实验处理的EA组ACTH、CORT含量明显降低,与Model组组间比较有显著性差异(P0.01);电针对衰老模型大鼠T细胞增殖效应的调节与电针对HPA轴ACTH、CORT的分泌水平呈负相关,与CRH无明显相关性; 7.海马GRmRNA表达完整,未被RNA酶降解;基因扩增产物只有单一峰值,扩增产物具有特异性;目的基因产物片断长度与设计长度相吻合;与Normal组比较,在Model组T细胞增殖能力降低、血清CORT水平明显升高同时,海马GRmRNA表达明显降低(P0.01);经电针强壮穴处理后,T细胞增殖能力升高、血清CORT水平降低,EA组与Model组比较有显著性差异(P0.01),海马GRmRNA表达也明显升高(P0.01);RU486组海马GRmRNA表达比Model组明显降低(P0.01,或P0.05);与RU486组比较,EA+RU486组海马GRmRNA表达有所增加,但组间无显著性差异(P0.05);EA+RU486组GRmRNA的表达与EA组相比明显减少(P0.01)。 结论: 通过本课题研究,我们认为,电针强壮穴调控T细胞免疫延缓衰老的作用机制是多环节、多途径的: 1电针强壮穴能通过提高衰老模型大鼠T细胞增殖、T细胞诱生IL-2和IL-2R的水平、CD8~+T细胞表面CD28的表达,调节T细胞免疫功能延缓衰老; 2电针强壮穴能从T细胞增殖能力、T细胞分泌IL-2和IL-2R的水平以及CD8~+T细胞表面抗原CD28表达等方面对抗环磷酰胺的免疫抑制作用,采用这种以治为防的策略,能增强老年个体免疫防御能力,电针强壮穴延缓衰老具有“治未病”效应; 3电针强壮穴增强T细胞免疫功能,与电针对神经内分泌系统调节有关:(1)电针强壮穴能降低外周血IL-6分泌和海马IL-6R表达,并增加海马GRmRNA表达,进而增强海马对HPA轴的负反馈调节,降低体内高水平ACTH、CORT对T细胞的免疫抑制;(2)电针能提高下丘脑β-end表达,可能与海马功能恢复,增强对下丘脑β-end的良性调节、降低β-end向外周过多分泌造成对T细胞免疫功能的抑制效果。同时可能与提高β-end对外周ACTH和GC的负反馈调节能力有关; 4.RU486能阻断电针调控海马对HPA轴的负反馈调节效应,并影响电针对T细胞免疫增殖的疗效,推测海马GR是实现海马对HPA的负反赖鹘诤投韵虑鹉粤夹缘鹘凇⒓潭訲细胞免疫产生调控作用的重要物质。 综上所述,我们认为电针强壮穴调控T细胞免疫是通过神经-内分泌-免疫网络多个环节实现的,海马GR是实现神经内分系统对T细胞免疫产生调控作用的重要物质。血清IL-6,海马IL-6R,下丘脑β-end以及下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴上CRH、ACTH和CORT参与了这个网络的具体调节过程。 本课题在探讨针灸延缓衰老的机制中,从T细胞免疫入手,从神经-内分泌-免疫调节(NIM)网络综合探讨针灸调节免疫延缓衰老的作用机制,为阐明针灸作用机制提供科学的实验依据,在针灸调节免疫延缓衰老的同类报道中尚不多见;课题采用提前电针干预衰老模型大鼠,然后对大鼠进行免疫抑制刺激,探讨了“逆针刺”(提前针刺)对衰老机体免疫能力的调节影响,证实“逆针刺”强壮穴可以提高衰老机体的免疫抗病能力,验证了针灸治未病以治为防的策略的可行性和科学性。 本课题未能观察β-end在外周血液的分泌情况,对实验结论的进一步证实造成了欠缺,有待今后在相关实验中继续完善。


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